光學顯微鏡zui重要的部件物鏡的特性介紹

今天和大家談談光學顯微鏡當中zui重要的部件：物鏡。為什么是zui重要且沒有之一呢？因為科研工作者們關心的解析度、信噪比等與成像質量息息相關的參數都是由物鏡決定的。當然，顯微鏡的其他部分也一樣*，但是篇幅有限，即便是物鏡，我們也只能淺嘗輒止的談一談。

 在生命科學研究領域，光學顯微鏡的使用率位列儀器的，如果有人不相信，那請看看周圍吧，不管是在實驗室，還是在醫院，我們都隨處可見顯微鏡們靚麗的身影。

而隨著科學技術的不斷進步，在光學顯微鏡的基礎上，衍生出許多其他復雜的成像系統。例如全內反射熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、多光子激光掃描顯微鏡等等。絕大多數的科研工作者們，都需要或多或少的和顯微鏡大家族中的成員們打交道。這個時候，對這些復雜系統的了解就有一些迫切了。

那么作為物鏡當中，zui不可不談的東西就是物鏡的zui重要的參數：數值孔徑。

數值孔徑即Numerical Aperture  所以在中國我們通常稱之為NA值，NA值的大小直接標注在物鏡上，大家平時切換物鏡的時候，有觀察過嗎？通常來說NA值越大，物鏡的成像質量越好。為什么會這么說呢？我們先來看看數值孔徑的計算公式：
NA = n (sin µ)
其中n是物鏡與樣本之間介質的折射系數，µ是物鏡孔徑角的一半。

作為生命科學領域的研究者，我們不必去深究為什么NA的公式是如上所示，但是，我們需要了解的是為什么NA值是物鏡zui重要的參數，所以趁熱打鐵，我們再看看下面兩個公式：
R= 1.22λ / [NAObj + NACon]
R = 1.22 • λ/(2 • NA)
上面兩個公式的左邊R，決定了物鏡的分辨率，即物鏡可以區分兩點間的zui短距離。接著我們再看看公式的右邊，λ是入射光的波長，實驗條件恒定的情況下，跟數值一樣都是定制，而我們看到NA都是處在分母的位置上，即NA值越大，R的數值就越小，分辨率就越高，所以我們觀察樣本的解析度就越高，通俗點來說，就是可放大的倍率越大。那么為什么會兩個公式呢？因為*個是透射光的計算公式，另一個是反射光的。順帶一提的是，通常來說NACon即聚光鏡的數值孔徑要小于高倍物鏡的數值孔徑，所以熒光成像的分辨率要高于明場成像。

談到反射光，作為現如今zui重要的成像手段，熒光成像在顯微成像領域毋庸置疑的處在壟斷地位，這里筆者不得不多談一下她，因此為大家介紹如下公式：
Intensity ∝ (NAobj)4/Mag2
在這個公式中Intensity的大小指的是熒光的強度值，而NA值這一次出現在了分子的位置，所以NA值越大，熒光強度越大，所以得到的熒光圖像信噪比越高，圖片質量越好。如果是進行時間序列成像，高NA值的物鏡，還能大大減少曝光時間，提高成像速度，從而更好的捕捉快速移動的熒光標記物。

 綜上所述，雖然較為粗略和淺顯，但是我們依然可以大致了解NA值的重要性，同時也對物鏡也有了初步的了解，那么隨之而來的問題就出現了：

NA既然如此重要，為什么物鏡種類卻如此千差萬別 ？

既然NA值如此重要，顯微鏡廠商們都只生產高數值孔徑的物鏡不就好了？為什么還要生產那么多種類繁多的物鏡呢？我們再回過來看看NA的計算公式：
NA = n (sin µ)
NA的大小跟介質的折射率有著直接的關系，如果各位生命科學研究者高中數學還沒有忘干凈的話，應該知道sinzui大值只有1，所以介質折射率越大，物鏡的NA值越大，這也是為什么我們高倍顯微鏡是油鏡的原因。

答案也就隨之而來，很顯然，如果樣本不能接觸，或是加入其他介質，我們就只能選擇空氣作為介質，從而限制里物鏡的NA值大小。那么如果可接觸的話，是不是所有的樣本都用高折射率的介質呢？下面我們再來看看下面要說的概念。

深層成像：球差的困擾！

上面這組實驗中，我們對折射率為1.38的樣本進行了200um的成像，分別用了三種不同的介質，分別是：水折射率為1.33；硅油折射率為1.40；油折射率為1.51。在樣本表面成像時，油介質無愧其高NA值的*特性，成像亮度是三種物鏡之中zui高的，但是當觀察深度至200um的時候，油介質的物鏡基本無法觀察到熒光型號，而在深層觀察時，成像質量的是折射率為1.4的硅油物鏡。Why？細心的同學們應該會發現，我們所用的樣本介質為1.38，而硅油的折射率是zui接近樣本的，所以在深層成像的時候，介質差所造成的球差就會被減到zui小。這種光學現象對于學生物的同學來說可能較難理解，但是我們從左邊的示意圖可以看出來，當介質相近的時候，光路的焦點匯聚更加容易而不會產生在深層觀察時候光線分散的情況，從而能獲得較好的深層次的熒光信號。

由上面這組實驗，我們可以得到很多有用的信息，好學的同學就會去查詢自己常用的樣本的折射率了吧？通常來說細胞樣本的折射率在1.33~1.35，活體或者厚組織的折射率在1.36~1.38，因此，當我們的實驗需要進行深層成像的時候，對于細胞樣本我們需要盡量選用水介質的物鏡，而當進行厚組織樣本或者果蠅斑馬魚這樣的活體深層成像時，使用硅油介質的物鏡得到的圖像質量會更加出色。當然，如果只是樣本表面成像，油鏡的成像質量是的。

伴隨著深層成像的迫切需求，空間的共定位分析，也被各位研究者們廣泛使用，傳統的2D共定位分析得到的結果往往是錯誤的不真實的。但是對于空間共定位來說，我們不可避免的就又要考慮另一個重要的物鏡參數色差矯正。

空間共定位分析：不可不談的色差

色差是什么？色差又是如何產生的？上面的圖例中展示的就是色差的概念。通俗點來說就是由于不同顏色的光波長不一樣，所以當她們通過光學部件的速度也不一樣，因此產生了一個光斑在成像的時候顏色分散開的情況產生，這就是色差。

對于顯微鏡廠商的物鏡系列，對于綠色紅色的矯正都相當的出色，但是，絕大多數廠家對于近紫外的矯正都不盡如人意。這一點瑕疵在進行空間核定位的時候，就會出現很嚴重的問題，在獲得成像結果之后，我們很難確定我們的熒光標記物與核的關系是真實的，還是由于色差造成的。

對此，各家廠商都有相對應的手段，但是只有OLYMPUS在物鏡上下了功夫，推出了一款號稱SC（超級色差矯正）的60倍物鏡，恰巧筆者手上真好有這枚物鏡，便做了如下測試。

上組實驗圖片用自發熒光小球作為樣本，用不同激發光成像，之后做了3D重構。從圖片中我們可以看出，即便是OLYMPUS顯微鏡的物鏡近紫外的色差依然有0.5um左右的偏差，而SC物鏡的兩種顏色基本切合，誤差要小于0.1um，基本上在核定位上就可以得到比較真實的實驗結果了。

雙光子物鏡：顛覆性的物鏡設計理念

說了這么多概念性的東西，其實僅僅只是管中窺豹，顯微鏡系統要更加復雜的多，在zui后的篇幅中，筆者也緊跟時代潮流，談談現在打得火熱的雙光子顯微鏡的物鏡。

雙光子的成像原理使用過雙光子的同學們應該都很清楚，不同于普通的光學顯微鏡和共聚焦系統所采用的線性光學，雙光子成像原理采用的是非線性光學，同時光源也不再是傳統的可見光，在物鏡的設計上不再是傳統那種“真實還原樣本”這樣的理念了。針對雙光子成像OLYMPUSzui早推出了雙光子成像的物鏡，在之后Nikon也緊跟步伐推出了相應的產品。

雙光子物鏡首先zui重要的是NA值盡量的大，這樣可以有效的提高激發效率。同時，由于使用近紅外成像，物鏡的色差矯正也不再針對可見光而是專門對于近紅外光進行矯正。在保證高NA的同時，雙光子物鏡的放大倍率會較小，這樣可以有效的提高收集視場，增加我們收集散射熒光信號的能力，從而提高成像質量。當然，這種雙光子物鏡只能使用在雙子系統上，若是在共聚焦系統中使用，效果是要大打折扣的。

本文來源于奧林巴斯中國，北京瑞科中儀專注顯微光學。