Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing

Topics：Mechanical stress, Cytotoxicity, Degranulation, Immune response, Biomechanics, Cancer treatment, Cell mechanics

腫瘤轉移的連續步驟包括腫瘤細胞從原發部位脫落、侵入周圍組織、在血管系統中內滲和存活，以及外滲到遠端部位并產生繼發性腫瘤。循環腫瘤細胞（CTCs）是從原發腫瘤中脫落并進入血液循環系統中的腫瘤細胞，CTCs會經歷多種環境壓力，例如失巢凋亡、缺氧、剪切應力、氧化應激和免疫監視。臨床研究報道，血液中 CTCs 的含量與癌癥患者的生存率高度相關。

免疫系統在腫瘤轉移的每一步都起著清除腫瘤細胞的重要作用。由于 CTCs 在血液中的半衰期較短（1-2.4 小時），因此通過免疫監測有效殺死這些腫瘤細胞需要直接快速的識別和細胞毒性。自然殺傷細胞（NK）細胞是先天免疫系統的重要組成部分，是 CTCs 的主要消除劑，可以通過一系列生殖性編碼的激活和抑制受體快速識別和殺死腫瘤細胞。

NK細胞表面的 NKG2D是一種重要的免疫激活型受體，它能夠識別多種配體分子，這些配體分子在免疫系統中扮演著關鍵角色。以往研究揭示了生物機械力如何通過選擇性機械調節配體的構象變化，從而賦予NKG2D識別不同配體的能力，這表明 NKG2D 可能是一種潛在的機械傳感器。

在血管系統中，CTCs 同時暴露于 NK 細胞和流體剪切力（FSS）。然而，它們對 CTCs 存活的協同作用仍不清楚，特別是FSS 是否能影響 NK 細胞對 CTCs 的細胞毒性。鑒于此，香港理工大學生物醫學工程系的研究團隊調查了 FSS 下 NK 細胞對 CTCs 細胞毒性的影響，剖析了剪切依賴性細胞毒性的潛在機制，包括 NK 分泌的細胞因子和顆粒酶B，還測試了 NKG2D 響應 FSS 的機械敏感性。研究成果發表于 APL Bioengineering 期刊題為“Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing"。

首先，為了研究 FSS 對 NK 細胞毒性的影響，使用懸浮乳腺癌細胞模擬CTCs，將其暴露于FSS（1和5 dyn/cm2）下。無論是否與NK細胞共培養，腫瘤細胞都表現出剪切依賴性死亡反應。重要的是，NK 細胞和 FSS 下腫瘤細胞的裂解率遠高于 NK 細胞或 FSS 誘導的死亡，特別是在 5 dyn/cm2 下。這表明 FSS 和 NK 細胞之間存在相互作用。同樣，在腫瘤細胞中觀察到剪切依賴性 caspase-3 激活和 caspase 活性增加，這可能部分解釋了剪切依賴性裂解反應。這些發現表明，FSS 可以促進 NK 細胞對 CTCs 的細胞毒性。

NK 細胞殺死 CTCs 的主要方式是與靶細胞作用形成偶聯物，通過免疫突觸釋放穿孔素在細胞膜上形成跨膜通道，并遞送主要效應酶顆粒酶B。為了闡明 FSS 如何增強 NK 細胞的細胞毒性，測試了 FSS 對偶聯物形成的影響。結果表明，腫瘤細胞和 NK 細胞之間的偶聯物形成隨著 FSS 的增加而減少（圖1 a），這可能是由剪切介導的干擾引起的。然而，FSS越高，形成的偶聯物中凋亡細胞越多（圖1 b）。此外，CD107a（NK 細胞活性標志物）的表達在 5 dyn/cm2 FSS 時顯著增加（圖1 c），表明剪切誘導 NK 細胞的激活。

NK 細胞的微管組織中心（MTOC）負責裂解顆粒的定向遞送。MTOC 和突觸之間的距離隨著 FSS 的增加而減小（圖1 d），表明 MTOC 極化依賴于剪切力。在 5 dyn/cm2 FSS 下，MTOC 更接近突觸（圖1 d），表明偶聯的 NK 細胞被激活。因此，在 5 dyn/cm2 FSS 下，更多的顆粒酶B 被遞送到偶聯的人乳腺癌MDA-MB-231 細胞中（圖1 e），這可能解釋了 NK 細胞對 CTCs 的細胞毒性增強。

另外 ，NK 細胞也可以通過分泌細胞因子（包括 TNF-α、IFN-γ）以及通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）誘導腫瘤細胞死亡。進一步的機制研究發現，不同水平的 FSS 下有和沒有腫瘤細胞時，TNF-α 的分泌沒有顯著差異。有趣的是，與 0 dyn/cm2 相比，IFN-γ 在 1 和 5 dyn/cm2 FSS 時下降。這表明 FSS 不促進 TNF-α 和 IFN-γ 的分泌。此外，還測試了這些細胞因子在 FSS 下的細胞毒作用，發現有或沒有 TNF-α 和 IFN-γ 時細胞凋亡沒有差異。在 FSS 下，從懸浮腫瘤細胞和 NK 細胞的共培養中收集條件培養基，發現在 1 和 5 dyn/cm2 下沒有細胞裂解的凈增量，表明 NK 細胞分泌的細胞因子可能無助于剪切誘導的 NK 細胞毒性增加。

上述結果表明，FSS 破壞 NK 和腫瘤細胞之間的偶聯物形成，同時促進 NK 細胞活化和顆粒酶B 在偶聯物到靶細胞的遞送，這可能會增強 NK 細胞的細胞毒性。

圖1    FSS促進顆粒酶B進入靶細胞。

NKG2D擁有多種配體，包括人類MHC-I類鏈相關分子（MICA和MICB）和人類UL16結合蛋白（ULBPs）。接下來，為了測試 NKG2D 在剪切誘導的 NK 細胞毒性中的作用，探討了 FSS 對 NKG2D 及其配體表達的影響。有趣的是，剪切處理對 NK 細胞中 NKG2D 的 mRNA 和蛋白質水平（圖2 a、b）以及 MDA-MB-231 細胞上的配體（圖2 c）沒有顯著影響。

進一步敲低 NK 細胞中的 NKG2D，發現沉默 NKG2D 在 5 dyn/cm2 FSS 下顯著降低了細胞毒性增量（圖2 d）。在 FSS 下，所有腫瘤細胞和偶聯細胞中顆粒酶B 的數量顯著升高，而 NKG2D 的抑制則減弱了這種效應（圖2 e、f）。

由于與靶細胞上的 MICA 連接后，PI3K 和 VAV1-Grb2 將在銜接蛋白 DAP10和 Gab2 的幫助下被募集到 NKG2D 的細胞內結構域，轉導激活信號，然后促進顆粒酶B 遞送到靶細胞中。因此實驗檢測了 FSS 下 PI3K 和 Gab2 信號的激活，發現與靜態條件相比，5 dyn/cm2 FSS 促進了突觸區域內 PI3K 和 Gab2 的磷酸化水平（圖2 g、h），抑制其表達則減少了剪切誘導的顆粒酶B 到腫瘤細胞中的遞送。這些結果表明，FSS 可能通過 NKG2D 介導的顆粒酶B 促進 NK 細胞的細胞毒性。

圖2    FSS通過NKG2D促進顆粒酶B進入靶細胞。

最后，研究探討了 NKG2D 是否能夠直接感知和響應 FSS。隨著 FSS 的增加，粘附的 NK 細胞在細胞膜上表現出 CD107a 表達升高（圖3 a），這表明 NK 細胞的細胞毒性增強。然而，FSS 不能促進粘附在整合素 LFA-1 配體 ICAM-1 包被底物的 NK 細胞中的 CD107a 表達。這些發現表明，剪切誘導的 NK 細胞激活可能是通過直接的 NKG2D-MICA 力感應介導的。在與 MICA 相互作用時，NKG2D 胞內結構域的接頭蛋白 DAP10 募集 Grb2-VAV1 和 PI3K 以促進免疫突觸形成和 NK 細胞活化。

酪氨酸蛋白激酶Lck 可磷酸化 VAV1和 PI3K以啟動下游信號傳導。熒光共振能量轉移（FRET）測量Lck活性發現，FSS 可以在 NK 細胞與靶細胞偶聯后促進 Lck 活性。沉默 NKG2D 可減少 FRET 比率的下降，并將 Lck 活性恢復到對照水平（圖3 b）。FSS 還促進了免疫突觸內磷酸化 VAV1 的積累，沉默 NKG2D wanquan減弱了 VAV1（圖3 c）。此外，在 FSS 下，PI3K 下游 Akt 的磷酸化顯著增強，敲低 NKG2D 可以抑制這種效應（圖3 d）。FSS 還可以促進與靶細胞結合后NK 細胞的 MTOC 極化（圖3 d），沉默 NKG2D 則減弱這種效應（圖3 e）。這些結果表明，激活受體 NKG2D 在與 MICA 結合后可以通過激活下游 Lck/Grb2/VAV1/PI3K 信號來直接感知和響應 FSS，這可能促進 NK 細胞的細胞毒性。

圖3    NKG2D對FSS具有機械敏感性。

總之，該研究報道了 FSS 以剪切依賴性方式增強 NK 細胞對 CTCs 的細胞毒性。腫瘤細胞死亡的增加歸因于剪切誘導的 NK 細胞活化，然后將更多的顆粒酶B 輸送到 CTCs 中以誘導細胞凋亡，而分泌的細胞因子和死亡配體的作用是非必要的。重要的是，當與配體 MICA 結合時，NKG2D 可以直接感應 FSS 以促進 NK 細胞活化和細胞毒性。沉默 NKG2D 消除了 FSS 介導的 NK 細胞活化、顆粒酶B 遞送和 CTCs 的增量死亡。這些發現揭示了一種 NK 細胞對CTC 的機械調控殺傷機制，這可能為基于 NK 細胞的免疫治療提供一種新的機械靶向策略。

參考文獻：Hu B, Xin Y, Hu G, Li K, Tan Y. Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing. APL Bioeng. 2023 Aug 11;7(3):036108. doi: 10.1063/5.0156628. PMID: 37575881; PMCID: PMC10423075.

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