Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes

Keywords: Calcium signaling; Cardiology; Cytokines; Inflammation; Surgery.

先天性心臟病是最常見的出生缺陷，在大多數心臟手術中，患者接受體外循環（CPB），以盡量減少心臟手術時的缺血性損傷。不良的術后結局與 CPB 手術期間和之后的嚴重全身炎癥反應有關。在 CPB 患者的血漿中一直觀察到促炎細胞因子，特別是 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α的激增。

盡管全身炎癥與器官損傷密切相關，但其發生機制尚不清楚。一個主流假設是 CPB 激活炎性白細胞，在 CPB 后外滲并浸潤到不同的器官，導致器官功能障礙。炎性白細胞（包括分化的巨噬細胞）將細胞因子和破壞性可溶性因子釋放到周圍組織，這些細胞也可能在浸潤時死亡，因為 CPB 和特別高的剪切應力被證明能夠誘導單核細胞死亡。壞死是細胞死亡的炎癥模式，被認為比細胞凋亡更具破壞性。迄今為止，CPB 激活的白細胞死亡和細胞死亡的確切模式（如果確實發生）的實驗證據仍然缺乏。

基于此，美國華盛頓大學醫學院心臟病學系、加州大學圣地亞哥分校醫學院醫學系及西奈山伊坎醫學院心血管外科團隊的一項研究曾使用兒科患者樣本、幼豬 CPB 模型和新開發的體外 CPB 模型來表征 CPB 及其特異因子如何誘導全身炎癥的分子機制。研究確定了高剪切應力是一種 CPB 特異性因子，足以通過鈣依賴性信號通路顯著上調人單核細胞中 IL-8 和 TNF-α 的生成；且發現CPB 誘導的大量炎性單核細胞亞群死于細胞凋亡和 TNF α介導的壞死性凋亡，這可能導致 CPB 后的組織損傷。研究成果發表于 JCI Insight 期刊題為“Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes"。

首先，對新生兒心臟手術患者采集的白細胞進行mRNA測序。每簇基因的通路富集分析表明，在所有時間點，骨髓細胞都有很強的活化，特別是粒細胞粘附以及 IL-6 和 IL-8 信號。隨著時間推移，胞吐作用、IL-10 介導的抗炎細胞因子信號、TLR 信號和白細胞遷移逐漸增加。細胞類型特異性基因集富集分析證實了骨髓細胞，尤其是單核細胞，是驅動整體轉錄反應的主要細胞類型。由于炎性細胞因子是 CPB 后患者全身炎癥的標志，因此分析了 mRNA-Seq 數據中 IL1B、IL6、IL8 和 TNFA  4 種細胞因子的轉錄變化，兒科患者白細胞樣本和幼豬 CPB 模型均顯示僅發現 IL8 和 TNFA 的上調，而未檢測到 IL6。這些數據表明，暴露于 CPB 條件足以上調白細胞中 IL8 和 TNFA 的表達。

為了研究 CPB 誘導單核細胞中細胞因子產生的分子機制，將 THP-1 細胞（一種來自嬰兒的人單核細胞系）暴露于體外 CPB 條件中，并施加大范圍剪切應力（圖1 A）。與靜態對照相比，體外 CPB 條件在 THP-1 細胞中強烈上調 IL-8 和 TNF-α 的轉錄物和蛋白水平（圖1 B、C），IL1B 表達沒有顯著改變，且在2.1 Pa 剪切力處理的 THP-1 細胞中未檢測到 IL-1B 和 IL-6 蛋白水平的變化。這表明，體外CPB回路在上調IL-8和TNF-α方面概括了體內CPB數據。

與 CPB 回路相關的三個因素是暴露于 PVC、高剪切應力和快速冷卻/再加熱。為了剖析每種因素的影響，將靜態 THP-1 細胞與 PVC 管一起孵育，發現在37°C下單獨暴露于 PVC使IL8 的分泌上調了約 5 倍，而 TNFA 水平沒有顯著改變（圖1 D）。

當細胞在 37°C 下進行剪切處理以消除冷卻/復溫效應，或暴露于 0.63 Pa 的較低剪切應力下時，IL-8 和 TNF-α 在 mRNA 和蛋白質水平上的上調顯著降低（圖1 E、F）。特別是對于 IL8，在2.1 Pa高剪切應力和30°C低溫的CPB條件下，與靜態對照相比，IL8水平提高了約330倍（圖1 E）。

當細胞在 37°C 下承受 2.1 Pa 的高剪切應力時，與靜態對照相比，IL8 上調約 124 倍（圖1 E），這表明，冷卻/復溫的效果導致 IL8 水平的差異約為 2.7 倍。由于 PVC 暴露僅將 IL8 上調約 5 倍，因此推測與靜態條件相比，剪切應力對 THP-1 細胞中 IL8 mRNA 水平提升的貢獻最大。這種比較證明了剪切應力在 3 個 CPB 特異性因素中的主導效應，但沒有考慮協同作用的可能性。

圖1    體外CPB條件上調THP-1細胞中的IL-8和TNF-α。

接下來，研究了鈣是否對 CPB 激活的細胞因子生成至關重要。當細胞在無鈣培養基中進行剪切處理或當鈣離子螯合劑 EGTA 螯合細胞外鈣時，與對照培養基相比，CPB 誘導的 IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 和蛋白質水平的上調明顯減弱（圖2），表明鈣內流對于這種轉錄反應至關重要。

然后，利用抑制劑研究了特定鈣介導的信號通路。結果觀察到，MEK/ERK 通路的激活驅動 IL8 和 TNFA 的表達以響應 CPB。CPB也激活了 CaN/NFAT 通路。剪切處理后人原代 CD14+ 單核細胞的 Western blot 分析也支持 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路的激活。PKC 抑制劑 Go 6983 和 Sotrastaurin 可有效抑制 IL8 和 TNFA 上調，但 Western blot 分析未顯示 NF-κB 通路的激活，表明 PKC 抑制劑的抑制作用可能是由于 PKC 激活 MEK/ERK 通路的串擾。

由于鈣信號通路可以串擾和募集不同的轉錄因子，因此檢測了剪切處理的 THP-1 細胞中 4 種轉錄因子 NFAT、AP-1（p-c-JUN）、NF-κB p65 和 p-CREB 的核定位，發現只有 NFAT1 和 p-c-JUN 顯示出明顯的核定位，這被EGTA 抑制，但未檢測到 NF-κB p65 或 p-CREB 染色。這表明，MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 是 CPB 條件下激活的主要鈣信號通路。

此外，與靜態細胞相比，CPB 誘導的 IL8 啟動子激活導致剪切處理的 THP-1 細胞的熒光素酶活性增加約 1.5 倍。當 AP-1 的結合位點 #1 或 NFAT 的結合位點 #2 被刪除時，剪切后熒光素酶活性沒有增加。這些結果證實，AP-1 和 NFAT 在這 2 個相鄰結合位點的結合激活了 THP-1 細胞中的 IL8 轉錄。

圖2    細胞外鈣對于 CPB 誘導的 IL-8 和 TNF-α 上調至關重要。

（A 和B）當 THP-1 細胞在無鈣培養基或鈣螯合劑 EGTA 存在下暴露于剪切應力時，與相應的對照培養基相比，IL8（A）和 TNFA（B）的 mRNA 上調明顯減弱。（C） 在無鈣培養基中剪切處理的 THP-1 細胞中 IL-8 和 TNF-α 的蛋白水平顯著低于對照培養基。

研究發現，在暴露于體外 CPB 系統 2 小時后，大約 1.6% 的 THP-1 細胞立即破裂，可能是由于機械破壞。有趣的是，大量非貼壁 THP-1 細胞隨著時間的推移而死亡，具有凋亡和壞死細胞死亡的形態特征。細胞凋亡檢測發現，Q4的活細胞群隨著時間的推移顯著減少，Q3 的早期凋亡細胞數量在 24 小時后增加到約 13% ，Q2 中的壞死細胞提示晚期凋亡細胞、原發性壞死細胞或繼發性壞死細胞，在 24 小時后顯著增加至約 40%。Western blot 分析顯示，隨著時間的推移，剪切處理的 THP-1 細胞中壞死性凋亡通路中關鍵蛋白（p-RIPK1、p-RIPK3 和 p-MLKL）的水平增加，凋亡標志物水平也增加。該結果表明，THP-1 細胞在 CPB 后死于細胞凋亡和壞死性凋亡。

最后，研究人員探討了細胞死亡是由可藥物因子/信號通路精確介導的，還是僅僅是機械損傷的不可避免的結果。暴露于 CPB 條件將 THP-1 細胞更換為新鮮培養基，發現可以挽救細胞死亡（圖3 A、B）。實驗假設，要么是破裂細胞的不溶性殘余物，要么是剪切處理中的可溶性因子導致細胞死亡，然后發現從剪切后的培養基中去除殘余物或將殘余物添加到新鮮培養基中不會改變細胞死亡的百分比（圖3 B）。這一結果強烈表明，剪切處理的 THP-1 細胞釋放到上清液中的可溶性因子導致了細胞死亡。

由于 TNF-α 是已知的細胞死亡介質，因此研究了靶向可溶性 TNF-α 是否可以減少壞死性凋亡。用人源化 TNF-α 抗體處理的剪切 THP-1 細胞的壞死細胞死亡減少約 24%（圖3 C）。介導 TNF-α 細胞效應的受體 TNFR1的敲除可將壞死細胞死亡減少約 41%（圖3 D），并降低了裂解 caspase-3 和 p-RIPK1 的水平（圖3 E）。這些數據表明，細胞死亡部分是由 TNF-α 介導的。此外，當用人重組 IL-8、TNF-α 或兩者處理初始靜態 THP-1 細胞時，IL-8 和 TNF-α 的組合比單獨使用 TNF-α 處理誘導更多的細胞死亡。這表明，雖然 IL-8 不直接誘導細胞死亡，但它可能與 TNF-α協同作用驅動細胞死亡。

圖3    CPB 誘導的壞死性凋亡部分由 TNF-α 介導。

圖4    CPB 誘導的炎癥和器官損傷機制的模型。

CPB 條件，特別是高水平的剪切應力，通過鈣介導的 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路激活單核細胞并上調炎性細胞因子 IL-8 和 TNF-α 的產生。活化的單核細胞粘附并通過血管內皮遷移到外周器官，隨著時間的推移分化為巨噬細胞。巨噬細胞與剩余的活炎性單核細胞一起，將細胞因子、趨化因子和破壞性可溶性因子分泌到周圍組織環境中。活化單核細胞亞群因細胞凋亡和 TNF α 介導的壞死性凋亡而死亡。壞死性凋亡單核細胞破裂并釋放 DAMPs進一步損害器官。靶向 MEK/ERK/AP-1 和 CaN/NFAT 通路以減少單核細胞活化或中和 TNF-α 以防止壞死性凋亡，可以改善 CPB 后器官損傷。

這項研究shouci分析了新生兒CPB期間和之后循環白細胞的全球轉錄變化。總之，該研究通過證明單核細胞活化在全身炎癥中的關鍵作用以及炎性單核細胞死亡在組織損傷中的關鍵作用，使我們更接近于從機制上解開CPB中復雜的全身性炎癥反應。除了轉化潛力外，該研究還為響應流體剪切應力的循環白細胞的基本生物學提供了潛在的新理解。

參考文獻：Tu LN, Hsieh L, Kajimoto M, Charette K, Kibiryeva N, Forero A, Hampson S, Marshall JA, O'Brien J, Scatena M, Portman MA, Savan R, Benner C, Aliseda A, Nuri M, Bittel D, Pastuszko P, Nigam V. Shear stress associated with cardiopulmonary bypass induces expression of inflammatory cytokines and necroptosis in monocytes. JCI Insight. 2021 Jan 11;6(1):e141341. doi: 10.1172/jci.insight.141341. PMID: 33232305; PMCID: PMC7821587.

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