Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation

Keywords: BACH1; YAP; atherosclerosis; endothelial inflammation; hemodynamics.

動脈粥樣硬化是冠狀動脈疾病（CAD）的主要原因。內皮功能障礙和血管炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用。

全基因組關聯(lián)研究（GWAS）已發(fā)現(xiàn)與CAD 發(fā)病相關的多個基因多態(tài)性位點，轉錄因子BACH1（BTB-CNC 同源體1）的表達與冠心病風險位點rs2832227單核苷酸多態(tài)性密切相關，先前被確定為 CAD 的風險位點。以往研究表明，BACH1 增加內皮細胞（EC）凋亡，減少 EC 增殖和遷移，并抑制缺血和發(fā)育性血管生成。據(jù)報道，Bach1 的整體敲除可上調載脂蛋白E-缺陷小鼠的血紅素加氧酶-1（HO-1）表達并減輕動脈粥樣硬化。然而，BACH1 如何導致動脈粥樣硬化的潛在機制仍不清楚。

動脈分支和主動脈弓（AA）的血流模式受到干擾，內皮細胞中受擾動流影響的相關基因的表達促進動脈粥樣硬化的形成。YAP 是一種轉錄輔助激活因子，是由血管炎性細胞因子或振蕩剪切應力（OSS）誘導的白細胞-EC 粘附的關鍵介質，對血管炎性反應和動脈粥樣硬化至關重要。

基于此，復旦大學基礎醫(yī)學院孟丹教授團隊與復旦大學附屬浦東醫(yī)院余波教授團隊合作在Circulation Research期刊發(fā)表了題為“Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation"的研究成果。該研究旨在檢測內皮細胞 BACH1 在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用，利用生成的EC 特異性 Bach1 敲除小鼠，觀察到 Bach1 的缺失抑制了小鼠血管炎癥并減輕了湍流或西方飲食誘導的動脈粥樣硬化。基于研究結論，將 BACH1 確定為內皮炎癥和動脈粥樣硬化的一種新型調節(jié)因子。

首先，為了支持 BACH1 在動脈粥樣硬化中的潛在重要作用，研究人員分別證明了從有腦血管癥狀（短暫性腦缺血發(fā)作、一過性黑朦或中風）的患者中獲得的頸動脈斑塊中 BACH1 轉錄物的上調以及在ApoeKO高脂血癥小鼠的動脈粥樣硬化 AA 內皮中也觀察到 BACH1 表達的增加。這些結果提示，內皮細胞 BACH1 可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)展。

為了研究不同的血流模式是否在體外調節(jié) BACH1 表達中發(fā)揮作用，測量了受振蕩流（OSS，± 4 dynes/cm2，1Hz，6/24h）的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中的 BACH1 蛋白水平。結果發(fā)現(xiàn)，與層流剪切應力相比，暴露于 OSS 的 HUVECs 中 BACH1 表達和核定位增加。然后，研究了 BACH1 是否介導了OSS 下 ECs 的促炎反應，發(fā)現(xiàn)OSS 上調了粘附分子 （ICAM1、VCAM1）的水平，而 BACH1 的敲低減弱了這種反應。

同時，構建了內皮特異性 Bach1 ECKO缺失小鼠，在高膽固醇飲食 4 周后通過部分結扎左頸動脈在體內探索OSS 相關的動脈粥樣硬化是否由內皮 BACH1 介導，正如預期，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Bach1 ECKO小鼠在4 周后斑塊形成減少。這些結果確定了BACH1 是血流紊亂相關動脈粥樣硬化的潛在介質。

為了探討B(tài)ACH1 在高膽固醇血癥小鼠動脈粥樣硬化病變形成中的作用，用AAV8-PCSK9D377Y  感染Bach1 ECKO小鼠和Bach1 WT對照小鼠。與 WT 對照相比，Bach1 ECKO降低了雄性和雌性小鼠主動脈中的油紅 O 染色（圖1 A、B），兩者均表現(xiàn)出位于 AA 和胸主動脈（TA）處的病變減少（圖1 C）。組織學分析表明，Bach1 ECKO減小了動脈粥樣硬化斑塊的大小（圖1 D），且主動脈根部切片病變內 Mac3⁺ - 巨噬細胞的數(shù)量減少（圖1 E）。經(jīng)過 12 周的高膽固醇飲食，Bach1 ECKO小鼠血漿 TNF-α 和 IL-1β 水平顯著降低（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)表明，Bach1 的缺失減輕了雄性和雌性小鼠的動脈粥樣硬化病變。

圖1    內皮細胞特異性缺失Bach1改善西方飲食誘導的動脈粥樣硬化。

單核細胞對ECs 的粘附是動脈粥樣硬化的初始步驟。因此，接下來研究了 EC-BACH1 在單核細胞粘附中的作用。值得注意的是，在小鼠和人類細胞中均觀察到EC-Bach1 的缺失降低了單核細胞-內皮細胞的粘附，而BACH1 的過表達增強了雙方的粘附作用。

進一步地，在 ECs 中進行了 BACH1 功能喪失或功能獲得，并檢測了粘附分子、促炎細胞因子和趨化因子的表達。結果發(fā)現(xiàn)，敲低 BACH1 降低了 TNF-α誘導的粘附分子（ICAM1 和 VCAM1）和趨化因子（MCP1和 CCL5）在 HUVCEs 中的表達。與體外發(fā)現(xiàn)一致，與 WT 小鼠相比，Bach1 ECKO 小鼠的動脈粥樣硬化病變和ECs中 ICAM1 和 VCAM1 表達顯著降低。內皮 Bach1 的缺失也減弱了 TNF-α誘導的Bach1 ECKO小鼠內皮細胞中粘附分子和趨化因子（Mcp1和Ccl5）的mRNA表達。這些結果表明，BACH1 通過促進單核細胞-內皮粘附以及粘附分子和促炎細胞因子的表達參與動脈粥樣硬化的啟動。

為了探索 BACH1 是否與 YAP 相互作用，進行了免疫共沉淀測定，進一步證實了生理條件下BACH1 與 YAP 在細胞核和細胞質中的共定位。此外，觀察到 TNF-α 以時間依賴性方式增加 ECs 中 BACH1 和 YAP 的蛋白水平，促進了兩者之間的相互作用，并增加其在 ECs 中的核定位。當 HUVECs 暴露于 OSS 時，也觀察到 ECs 中 BACH1 和 YAP 的核定位增加。ChIP-qPCR 檢測證實了 BACH1 和 YAP 均與 ICAM1 和 VCAM1 的啟動子結合。TNF-α 刺激增強了 BACH1 和 YAP 對這些基因啟動子的富集。這些數(shù)據(jù)表明，BACH1 是 YAP 的轉錄相互作用伴侶，TNF-α 促進 BACH1 和 YAP 的核積累，增加它們對粘附分子啟動子的募集，進而驅動粘附分子在 ECs 中的轉錄。

在 YAP 基因啟動子區(qū)域鑒定出 BACH1 結合位點（圖2 A），因此研究假設 BACH1 可能與 YAP 的啟動子區(qū)域結合并調節(jié) YAP 表達，觀察到 ECs 中BACH1 過表達顯著增加YAP 表達，而 BACH1 敲低減少YAP 表達（圖2 B）。此外，BACH1 過表達增強，其敲低降低 YAP mRNA 水平和啟動子活性（圖2 C）。ChIP-qPCR 檢測證實了 BACH1 與 ECs 中的 YAP 啟動子結合（圖2 D）。BACH1 過表達增加了 YAP 熒光素酶報告基因構建體的活性，但不影響含有BACH1結合位點突變的YAP熒光素酶報告基因（圖2 E）。這些數(shù)據(jù)表明，BACH1 與 YAP 啟動子結合并激活其轉錄。

然后，研究又探討了 TNF-α誘導的 YAP 核積累是否依賴于 BACH1。正如預期，敲低 BACH1 降低了 TNF-α誘導的 YAP 蛋白表達（圖2 F），降低了 YAP 核定位（圖2 G），并在 TNF-α刺激后減少了 YAP 對 ICAM1 和 VCAM1 基因的富集（圖2 H）。與體外結果一致，與WT小鼠相比，Bach1 ECKO小鼠動脈粥樣硬化病變中內皮細胞YAP的表達降低（圖2 I）。

圖2    BACH1 結合到YAP啟動子上激活其轉錄。

最后，研究探討了YAP 過表達是否可以在體內消除 Bach1 缺失介導的抗動脈粥樣硬化作用。實驗觀察到，Bach1 ECKO 小鼠的動脈粥樣硬化病變面積、ICAM1和斑塊內膜巨噬細胞浸潤（圖3 A-C）以及血漿IL-1β水平（圖3 D）均顯著降低，而YAP過表達的Bach1 ECKO小鼠則沒有顯著降低。這表明，EC 特異性 YAP 過表達在體內抵消了 Bach1 缺失介導的抗動脈粥樣硬化作用。

此外，與健康主動脈相比，BACH1 和 YAP 在有動脈粥樣硬化斑塊的人主動脈內膜中高表達（圖3 E），且觀察到共定位（圖3 E）。同時，BACH1 的 mRNA 表達與人頸動脈斑塊中的 YAP、ICAM1、IL-1β、VCAM1 和 CCL5 呈正相關（圖3 F）。

進一步地，為了探究現(xiàn)有的抗動脈粥樣硬化藥物是否抑制 BACH1 表達，研究人員還測試了幾種藥物，發(fā)現(xiàn)他汀類藥物降低了 BACH1 mRNA 水平，尤其是瑞舒伐他汀（Rosuvastatin）。瑞舒伐他汀在 TNF-α刺激后顯著降低 BACH1 和 YAP 表達，并減弱 TNF-α誘導的 ICAM1 和 VCAM1 表達。但是，瑞舒伐他汀未能抑制 BACH1 誘導的粘附分子和趨化因子的表達，在 TNF-α刺激下，BACH1 敲低的 HUVECs中粘附分子和趨化因子的減少也不受瑞舒伐他汀的顯著影響。

為了進一步測試瑞舒伐他汀是否影響體內動脈粥樣硬化易感內皮中 BACH1 的表達，用 AAV8-PCSK9D377Y 感染 WT 雄性小鼠，喂食8 周西方飲食，然后胃內給藥瑞舒伐他汀持續(xù)2 周。與體外研究結果一致，瑞舒伐他汀顯著降低動脈粥樣硬化敏感的 AA 內皮細胞中 BACH1 和 YAP 的表達，還減弱了 ICAM1、IL-1β 和 CCL5 的表達。這些數(shù)據(jù)表明，瑞舒伐他汀抑制BACH1 可能參與了抗炎和抗動脈粥樣硬化作用。

圖3    內皮細胞特異性YAP 過表達可抵消BACH1 缺失介導的體內抗動脈硬化作用。

圖4    圖形概要

BACH1 是內皮細胞炎癥和動脈粥樣硬化的關鍵介質。在血流受干擾或 TNF-α刺激后，BACH1 和 YAP 被誘導并易位到 ECs 的細胞核中。BACH1 通過與 YAP 啟動子結合來上調 YAP 表達，BACH1 與 YAP 形成復合物，誘導促炎基因的轉錄。瑞舒伐他汀通過降低 BACH1 的表達減輕內皮炎癥和動脈粥樣硬化。

綜上所述，該研究結果表明，BACH1 作為新的血流動力學機械傳感器，激活內皮細胞，并促進動脈粥樣硬化。此外，BACH1-YAP 轉錄網(wǎng)絡在促進內皮炎癥和動脈粥樣硬化生成方面至關重要。他汀類藥物對 BACH1 的抑制作用使 BACH1 成為一種治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的新靶點。

參考文獻：Jia M, Li Q, Guo J, Shi W, Zhu L, Huang Y, Li Y, Wang L, Ma S, Zhuang T, Wang X, Pan Q, Wei X, Qin Y, Li X, Jin J, Zhi X, Tang J, Jing Q, Li S, Jiang L, Qu L, Osto E, Zhang J, Wang X, Yu B, Meng D. Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation. Circ Res. 2022 Apr;130(7):1038-1055. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319540. Epub 2022 Feb 24. PMID: 35196865.

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