Endothelial oestrogen-myocardial cyclic guanosine monophosphate axis critically determines angiogenesis and cardiac performance during pressure overload

Keywords: Angiogenesis; Cyclic GMP; Heart failure; Mice; Non-nuclear signalling; Oestrogen; Transgenic.

心力衰竭是一種嚴(yán)重的疾病，發(fā)病率和死亡率很高。老年人群心力衰竭的患病率增加，尤其是絕經(jīng)后女性發(fā)生射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭（HFpEF）的患病率明顯更高，提示絕經(jīng)后雌激素缺乏可能參與其發(fā)病機(jī)制。另一方面，心力衰竭治療效果的性別差異已被強(qiáng)調(diào)，其中可能涉及多種因素。基于性別的亞組分析測(cè)試了血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑（ARNi，心衰治療藥物）對(duì) HFpEF 患者的療效，發(fā)現(xiàn)女性的治療效果優(yōu)于男性。考慮到 ARNi 作為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）蛋白激酶G（PKG）激活的作用機(jī)制，cGMP-PKG 通路可能特別參與絕經(jīng)后女性心力衰竭的病理生理學(xué)。

雌激素在維持女性心血管穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，其中多種作用由雌激素受體介導(dǎo)，包括雌激素受體（ER）α、ERβ、G 蛋白偶聯(lián)ER（GPR30）和其他雌激素亞型。據(jù)報(bào)道，這三種受體均介導(dǎo)雌激素對(duì)心血管的有益作用，其中 ERα 被特別清楚地描述為通過(guò)其非核作用與內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）偶聯(lián)，從而與 cGMP 信號(hào)通路結(jié)合，在血管保護(hù)中起著重要作用，而其核途徑可防止骨質(zhì)流失、2 型糖尿病代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化。

基于此，日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院心血管醫(yī)學(xué)系的一項(xiàng)研究利用組織特異性 ERα 非核失活模型確定了內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)在女性心力衰竭中的作用。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)決定壓力超負(fù)荷期間的血管生成反應(yīng)和心臟功能，并且內(nèi)皮雌激素-心肌 cGMP 軸參與了這種調(diào)控。研究成果發(fā)表于 Cardiovascular Research 期刊題為“Endothelial oestrogen-myocardial cyclic guanosine monophosphate axis critically determines angiogenesis and cardiac performance during pressure overload"。

首先，通過(guò)比較雌激素在心肌細(xì)胞 ERα 缺失小鼠（ERαf/f/αMHCCre+）和內(nèi)皮細(xì)胞 ERα 缺失小鼠（ERαf/f/Tie2Cre+）中的心臟益處來(lái)確定 ERα 的組織特異性作用，發(fā)現(xiàn)雌二醇（E2）在 ERαf/f/Tie2Cre+ 中并不明顯，但顯著改善了 ERαf/f/αMHCCre+ 的心臟功能。這表明，內(nèi)皮細(xì)胞 ERα，而不是心肌細(xì)胞 ERα，是雌激素對(duì)心臟功能有益影響的關(guān)鍵。

然后，利用一種新型小鼠模型，在ECs 中選擇性失活 ERα 非核信號(hào)（ERαKI/KI/Tie2Cre+）來(lái)確定內(nèi)皮 ERα 介導(dǎo)的心臟保護(hù)作用。與補(bǔ)充 E2 的野生小鼠相比，突變小鼠（ERαKI/KI/Tie2Cre+）在橫向主動(dòng)脈收縮（TAC）后表現(xiàn)出明顯更差的心臟功能（圖1 A、B），且雌激素對(duì)突變動(dòng)物心臟功能的有益影響減弱。相反，補(bǔ)充 E2 的野生型和突變動(dòng)物的心臟肥大同樣減弱（圖1 C）。

使用 PV 環(huán)分析進(jìn)行的詳細(xì)心臟功能評(píng)估顯示，突變型 TAC 心臟的 dP/dt max/IP、收縮末期壓力-容量關(guān)系 [ESPVR（mmHg/μL）、前負(fù)荷降低期間的左上限關(guān)系] 和 EF 值均顯著低于野生型 TAC 心臟（圖1 D、E）。突變型 TAC 心臟的舒張末期壓力-容量關(guān)系 [EDPVR （mmHg/μL），前負(fù)荷降低期間的右下限關(guān)系] 高于野生型 TAC 心臟。這表明，在沒(méi)有內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)的情況下，TAC 后收縮和舒張功能嚴(yán)重受損。此外，實(shí)驗(yàn)確定了 ERβ 信號(hào)對(duì) E2 抗肥大作用的貢獻(xiàn)。用 PHTPP 抑制 ERβ 信號(hào)顯著減弱了 E2 介導(dǎo)的 ERαKI/KI/Tie2Cre+ TAC 心臟的抗肥大反應(yīng)，對(duì)心臟功能的影響最小，表明 ERβ 在抗肥大機(jī)制中的作用。

這些結(jié)果表明，內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)有助于 E2 對(duì)心臟功能的有益影響。

圖1    內(nèi)皮特異性消融ERα非核信號(hào)（OVX + E2）的動(dòng)物心臟表型暴露于左室壓力超負(fù)荷3周。

在補(bǔ)充 E2 的條件下，ERαKI/KI/Tie2 Cre+ TAC 心臟中 Nppb、Tgfb、Il1b 和 Il6 的 mRNA 表達(dá)水平均顯著高于野生型 TAC 心臟，而ERαKI/KI/Tie2Cre + TAC 心臟中 Atp2a2a2 和 Ppargc1a 的 mRNA 表達(dá)水平顯著降低于野生型 TAC 心臟，表明在沒(méi)有內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)的情況下，ERαKI/KI/Tie2 Cre+ TAC 心臟中發(fā)生了嚴(yán)重的病理重構(gòu)，導(dǎo)致壓力超負(fù)荷。此外，與野生型 TAC 心臟相比，突變型 TAC 心臟的心肌 PKG 活性顯著降低，表明內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)在壓力超負(fù)荷后女性心臟 PKG 激活中的關(guān)鍵作用。

CD31 染色評(píng)估顯示，在沒(méi)有雌激素的情況下，TAC顯著降低了野生型小鼠的毛細(xì)血管密度，但在有雌激素的情況下，毛細(xì)血管密度保持不變。相比之下，在突變型心臟中未觀察到TAC后雌激素的血管生成反應(yīng)。在雌激素存在的情況下，Vegfa（一種主要由 CM 分泌的有效血管生成因子）的 mRNA 上調(diào)在野生型心臟中被 TAC 顯著增加，但在突變型心臟中幾乎丟失。這表明，內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)與女性心臟壓力超負(fù)荷期間的血管生成反應(yīng)密切相關(guān)，有助于維持微循環(huán)。

接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)下游的 cGMP-PKG 通路是否直接調(diào)節(jié)用 sGC-cGMP 刺激后雌激素缺失的 TAC 心臟的血管生成。sGC 刺激激活了心肌 cGMP-PKG 并改善了心臟功能（圖2 A-D、F），即使在 ErαKI/KI/Tie2Cre- 和 ERαKI/KI/Tie2Cre+ 小鼠中都沒(méi)有雌激素的情況下，同時(shí)Nppb 基因表達(dá)減弱（圖2 E、G）。重要的是，無(wú)論內(nèi)皮 ERαKI/KI 基因突變?nèi)绾危?sGC 刺激治療的心臟都顯示毛細(xì)血管密度增加，與 Vegfa 的 mRNA 上調(diào)有關(guān)，表明通過(guò)直接激活心肌 cGMP-PKG 進(jìn)行血管生成控制。考慮到這些細(xì)胞是VEGF分泌的重要來(lái)源，隨后測(cè)試了CMs是否參與了這種調(diào)節(jié)。在從 ERαKI/KI/Tie2Cre- 小鼠心臟分離的培養(yǎng)基 CMs 中，sGC 刺激上調(diào)了 Vegfa 表達(dá)，也增加了培養(yǎng)基 VEGFa 濃度，表明 CMs 參與了通過(guò) sGC-cGMP 信號(hào)誘導(dǎo)的 Vegfa 表達(dá)（圖3 A、B）。

圖2    sGC刺激對(duì)壓力過(guò)載的ERαKI/KI/Tie2Cre- 和ERαKI/KI/Tie2Cre+  OVX心臟的影響。

最后，為了進(jìn)一步闡明 ECs 和 CMs 之間的交互機(jī)制，將從 ERαKI/KI/Tie2 Cre+ 小鼠或野生型小鼠中分離的 ECs 與來(lái)自雌性野生型小鼠的成年 CMs 共培養(yǎng)，并檢測(cè) E2 的影響。當(dāng) CMs 和野生型 ECs 共培養(yǎng)時(shí)，E2 顯著增加了 CMs 中的 Vegfa 表達(dá)以及培養(yǎng)基中的 VEGFa 量，而當(dāng) CMs 單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，雌激素對(duì) CMs 中的 Vegfa 表達(dá)或培養(yǎng)基中的 VEGFa 量沒(méi)有顯著影響（圖3 C、D）。重要的是，這種 VEGF 的產(chǎn)生被 NOS 抑制消除（圖3 C、D），并且當(dāng) CMs 與 ERαKI/KI/Tie2Cre+ 小鼠的 ECs 共培養(yǎng)時(shí)顯著減少（圖3 E、F）。進(jìn)一步利用 HUVECs 對(duì) ECs 進(jìn)行了遷移測(cè)定，以確定 CM 釋放的 VEGF 對(duì)該共培養(yǎng)系統(tǒng)中 ECs 的功能影響（圖3 G、H）。當(dāng) ECs 與 CMs 共培養(yǎng)時(shí)，E2 誘導(dǎo)的 EC 遷移增強(qiáng)，表明通過(guò)與 CMs 的相互作用激活了內(nèi)皮 VEGF 信號(hào)傳導(dǎo)。這些結(jié)果支持了 ECs 和 CMs 之間通過(guò) ERα 非核信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制聯(lián)系。

圖3    雌激素-cGMP 信號(hào)通路在 ECs 和 CMs 之間相互作用。

圖4    內(nèi)皮雌激素-心肌cGMP軸刺激血管生成反應(yīng)并改善壓力超負(fù)荷時(shí)的心臟功能。

總之，該研究表明，內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)在通過(guò) ERα 非核信號(hào) cGMP-PKG 軸介導(dǎo)的雌激素心臟功能益處中起關(guān)鍵作用，其中反應(yīng)性血管生成是通過(guò)內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)和心肌細(xì)胞 cGMP 信號(hào)之間的雙向相互作用誘導(dǎo)的。這項(xiàng)研究還闡明了 sGC 刺激的心臟保護(hù)機(jī)制之一：sGC 刺激激活的心肌細(xì)胞 cGMP 可以補(bǔ)償該軸，以及其他 cGMP-PKG 衍生的心臟益處，無(wú)論雌激素狀態(tài)或 EC 狀態(tài)如何。因此，這些發(fā)現(xiàn)構(gòu)成了使用 sGC 刺激器治療心力衰竭的另一個(gè)機(jī)制基礎(chǔ)。從雌激素的角度來(lái)看，靶向內(nèi)皮 ERα 非核信號(hào)可能是一種很有前途的心力衰竭治療方法，而不會(huì)因核信號(hào)而引起雌激素的不良副作用。研究結(jié)果還為我們理解 cGMP 相關(guān)心力衰竭治療中的性別差異提供了機(jī)制見解。

參考文獻(xiàn)：Fukuma N, Tokiwa H, Numata G, Ueda K, Liu PY, Tajima M, Otsu Y, Kariya T, Hiroi Y, Liao JK, Komuro I, Takimoto E. Endothelial oestrogen-myocardial cyclic guanosine monophosphate axis critically determines angiogenesis and cardiac performance during pressure overload. Cardiovasc Res. 2024 Dec 4;120(15):1884-1897. doi: 10.1093/cvr/cvae202. PMID: 39259833; PMCID: PMC11630045.

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