Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis

KWS：LncRNA H19；Subchondral Bone Osteocytes；Cartilage Degradation；Osteoarthritis

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨退化、滑膜炎癥和骨重塑。作為關(guān)鍵因素之一，據(jù)報(bào)道機(jī)械負(fù)荷對(duì)軟骨產(chǎn)生抗分解代謝和合成代謝作用，導(dǎo)致軟骨下骨重塑異常。骨細(xì)胞（Osteocytes）占骨細(xì)胞總數(shù)的 90% 至 95%，由于它們?cè)谡麄€(gè)骨基質(zhì)中廣泛分布，并且具有復(fù)雜互連的腔隙小管網(wǎng)絡(luò)，因此在感應(yīng)和傳遞機(jī)械刺激方面發(fā)揮著重要作用。因此，骨細(xì)胞可以響應(yīng)機(jī)械信號(hào)并分泌可溶性因子來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性。

已發(fā)現(xiàn)幾種長(zhǎng)鏈非編碼RNA （lncRNAs）與 OA 嚴(yán)重程度相關(guān)，并在體外影響 OA 關(guān)節(jié)組織來源的細(xì)胞功能。最近的證據(jù)主要表明，lncRNA H19（H19）與 OA 中的軟骨和滑膜變化之間存在關(guān)聯(lián)，但尚未明確關(guān)系。此外，H19 通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、骨再生和骨代謝參與維持骨質(zhì)量。值得注意的是，H19 已被證明會(huì)影響拉伸刺激下骨髓來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化能力。因此，有理由假設(shè) H19 可能能夠影響 OA 的軟骨下骨重塑，特別是響應(yīng)于機(jī)械變化，從而可能導(dǎo)致軟骨侵蝕和其他病理變化的進(jìn)展。

基于此，香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨傷學(xué)系及香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究為了探索靶向 H19 治療 OA 的轉(zhuǎn)化價(jià)值，開發(fā)了一種特定的基因遞送系統(tǒng)，將 Fe3O4納米顆粒和金屬有機(jī)框架（MOF）結(jié)合形成磁性 MOFs（MMOFs），并在外部磁場(chǎng)存在下將抗-H19 反義寡核苷酸（ASO）轉(zhuǎn)運(yùn)到軟骨下骨骨細(xì)胞中進(jìn)行體內(nèi)功能評(píng)估。研究成果發(fā)表于 Arthritis & Rheumatology期刊題為“Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis"。

從接受全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的 OA 患者中收集軟骨下骨組織，將軟骨侵蝕嚴(yán)重的內(nèi)側(cè)髁軟骨標(biāo)記為損傷，軟骨相對(duì)完整的外側(cè)髁軟骨標(biāo)記為未損傷以進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照比較。H19 的 FISH 染色顯示，損傷組軟骨下骨中 H19 陽(yáng)性骨細(xì)胞的比例顯著高于未損傷組，損傷組軟骨下骨中H19的高表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。在 OA 小鼠模型中，與人類 OA 樣本類似，發(fā)現(xiàn) H19、COX-2、OPG 和 DMP1 的表達(dá)顯著上調(diào)，特別是在軟骨下骨區(qū)域的骨細(xì)胞中。這些結(jié)果表明，骨細(xì)胞 H19 表達(dá)上調(diào)，并與 OA 軟骨下骨響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力的異常結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

為了研究骨細(xì)胞 H19 對(duì) OA 的影響，生成骨細(xì)胞 H19 cKO 小鼠（圖1 A），其在富含骨細(xì)胞的骨組織中顯著降低（圖1 B）。對(duì)照H19fl/fl（Flox）小鼠在 DMM 手術(shù)后表現(xiàn)出退行性軟骨損傷和軟骨下骨硬化，而 H19 cKO 小鼠幾乎不受 DMM 誘導(dǎo)的變化（圖1 C-E）。正如預(yù)期，H19 cKO 小鼠軟骨下骨骨細(xì)胞中 H19 上調(diào)的程度降低（圖1 C、F），與軟骨下骨細(xì)胞中 COX-2、OPG 和 DMP1 的蛋白表達(dá)顯著降低有關(guān)（圖1 G、H）。這些結(jié)果為骨細(xì)胞中 H19 的上調(diào)可以促進(jìn) OA 的發(fā)展和軟骨下骨改變提供了支持證據(jù)。

圖1     H19 缺失小鼠對(duì) OA 進(jìn)展和軟骨下骨重塑具有抵抗力。

接下來，為了探索 OA 中 H19 介導(dǎo)的骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，對(duì) MLO-Y4 細(xì)胞采用流體剪切力（FSS，2 Pa）刺激來模擬骨細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷的機(jī)械刺激（圖2 A）。FSS 的應(yīng)用導(dǎo)致 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比值和 Dmp1 的上調(diào)（圖2 B）。值得注意的是，先前的 H19 過表達(dá)增強(qiáng)了 MLO-Y4 細(xì)胞對(duì) FSS 誘導(dǎo)的這些機(jī)械反應(yīng)基因上調(diào)的反應(yīng)（圖2 B）。相比之下，ASO 敲低 H19 降低了 MLO-Y4 細(xì)胞對(duì) FSS 介導(dǎo)的 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比值和 Dmp1 上調(diào)的機(jī)械反應(yīng)（圖2 C）。

然后進(jìn)行RNA 測(cè)序分析，比較 ASO 處理和對(duì)照 MLO-Y4 細(xì)胞在 FSS 刺激下的變化，以確定潛在的潛在機(jī)制。簡(jiǎn)而言之，發(fā)現(xiàn) 451 個(gè)差異表達(dá)基因在 FSS 刺激后在 ASO 處理的細(xì)胞中的表達(dá)水平變化超過 1.5 倍。根據(jù)KEGG通路分類，26% 的基因與環(huán)境信息處理相關(guān)（圖2 E）。值得注意的是，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是最富集的一種（53.8%），基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)上調(diào)的基因與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)有關(guān)（圖2 D、F）。與之前的結(jié)果和 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)一致，PI3K/AKT 信號(hào)激活參與骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，AKT 和糖原合成酶激酶3（GSK3）的磷酸化在同時(shí)進(jìn)行 FSS 刺激和 H19 過表達(dá)后顯著增加（圖2 G）。隨著 H19 敲低，FSS 刺激未能激活 MLO-Y4 細(xì)胞中的 AKT/GSK3 信號(hào)通路（圖2 H）。LY290042（一種 PI3K 抑制劑）的預(yù)處理阻止了 H19 對(duì) AKT/GSK3 通路激活和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向表達(dá)的上調(diào)（圖2 I）。這些數(shù)據(jù)表明，H19 作為 PI3K/AKT/GSK3 信號(hào)通路的增強(qiáng)子參與骨細(xì)胞的機(jī)械反應(yīng)。

圖2      H19 通過 PI3K/AKT/GSK3 信號(hào)介導(dǎo)的骨細(xì)胞機(jī)械反應(yīng)。

為了進(jìn)一步研究 H19 對(duì)骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶點(diǎn)，比較了 FSS 刺激后 ASO 處理和對(duì)照 MLO-Y4 細(xì)胞中與 PI3K/AKT/GSK3 信號(hào)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因。在因 H19 還原而失調(diào)的候選信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中，Ppp2r1a 和 Ppp2r5d 屬于蛋白質(zhì)磷酸酶2A（PP2A）復(fù)合酶的亞基基因（圖3 A）。H19 過表達(dá)或缺失，獨(dú)立于 FSS 刺激，影響了骨細(xì)胞中 Ppp2r1a 和 Ppp2r5d 的表達(dá)（圖3 B、C）。

為了闡明 PP2A 在 H19 介導(dǎo)的骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，用 DT-601（PP2A 激活劑）或OKA（PP2A 抑制劑）在 FSS 刺激前干擾 PP2A。在 DT-601 存在下，響應(yīng) FSS 刺激和 H19 過表達(dá)的 Ptgs2、Tnfrsf11b、Opg/Rankl 比率和 Dmp1 的上調(diào)表達(dá)被消除，而 OKA 恢復(fù)了在FSS 刺激下由 H19 敲低引起的這些標(biāo)記基因的下調(diào)（圖3 D、E）。此外，H19 過表達(dá)激活的 AKT/GSK3 信號(hào)通路被 DT-601 抑制（圖3 F）。相比之下，即使在 H19 缺乏的情況下，OKA 也促進(jìn)了 AKT/GSK3 信號(hào)通路的激活（圖3 G）。這些結(jié)果表明，H19 通過 AKT/GSK3 信號(hào)通路對(duì)骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用可由 PP2A 介導(dǎo)。

為了探討 H19 和 PP2A 之間的相互作用，測(cè)定了 H19 過表達(dá)或敲低后骨細(xì)胞中 PPP2R1A 和 PPP2R5D 的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) H19 過表達(dá)降低其蛋白水平，而 H19 敲低誘導(dǎo)其蛋白水平，表明 H19 可能負(fù)向調(diào)節(jié) PP2A 的表達(dá)。鑒于 H19 主要存在于骨細(xì)胞的細(xì)胞核中，并且之前報(bào)道過 EZH2可被 H19 募集且可激活組蛋白H3賴氨酸27（H3K27me3）的甲基化，因此推測(cè) EZH2 抑制可能參與 H19 介導(dǎo)的 PP2A 抑制。MLO-Y4 細(xì)胞通過 H19 過表達(dá)證實(shí)了 H3K27me3 的誘導(dǎo)，其可被 GSK126（一種選擇性 EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）顯著抑制（圖3 H）。有趣的是，EZH2 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制以濃度依賴性方式增加 PPP2R1A 和 PPP2R5D 表達(dá)。抑制 EZH2 可以抑制 H19 對(duì) PPP2R1A 和 PPP2R5D 表達(dá)的抑制作用（圖3 I）。這些研究結(jié)果表明，EZH2 通過 PP2A 相關(guān)信號(hào)通路對(duì) H19 介導(dǎo)的骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)具有合理的調(diào)節(jié)作用。

圖3   通過 PP2A 調(diào)控H19 介導(dǎo)的骨細(xì)胞機(jī)械反應(yīng)和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。

最后，為了通過調(diào)節(jié)軟骨下骨重塑來確認(rèn) H19 作為 OA 治療靶點(diǎn)的潛力，設(shè)計(jì)了一個(gè) MMOF 納米平臺(tái)，以可控方式將抗-H19 ASO 輸送到靶點(diǎn)，ASO 成功與 MMOF 偶聯(lián)。ASO 釋放曲線表明，54% 的 ASO 在前 3 小時(shí)內(nèi)釋放，而在釋放培養(yǎng)基中孵育 6 小時(shí)后釋放百分比達(dá)到最大值。此外，在體外補(bǔ)充 MMOF 后有效抑制骨細(xì)胞中 H19 表達(dá)揭示了 MMOF 將 ASO 遞送到具有適當(dāng)生物利用度的細(xì)胞的能力。

采用體內(nèi)熒光成像驗(yàn)證磁場(chǎng)暴露下 MMOF 在膝關(guān)節(jié)中的有效積累。吲哚菁綠（ICG）標(biāo)記的 MMOF 的熒光強(qiáng)度主要積累在暴露于外部磁場(chǎng)的目標(biāo)膝關(guān)節(jié)中，而沒有磁場(chǎng)暴露的對(duì)側(cè)顯示出微弱的熒光信號(hào)（圖4 A、B）。注射后 6 小時(shí)磁場(chǎng)暴露，負(fù)載有 ASO 的 MMOF 在膝關(guān)節(jié)的有效積累得到了證實(shí)的，因?yàn)榕c在整個(gè)研究期間沒有磁刺激的樣本相比，這些樣本中的熒光信號(hào)在膝關(guān)節(jié)中顯著更高（圖4 C）。由于 MMOF 一旦暴露在磁場(chǎng)中，就可以在關(guān)節(jié)中保留更長(zhǎng)的時(shí)間，因此它們?cè)诒┞队诖艌?chǎng)時(shí)會(huì)延遲循環(huán)到其他器官。MMOF 注射 24 小時(shí)后切除器官和膝關(guān)節(jié)的離體圖像顯示，肝臟和腎臟中具有顯著的熒光信號(hào)，表明在后續(xù)治療中其他器官可能存在毒性積累（圖4 D）。

用 DMM 誘導(dǎo)的 OA 小鼠模型評(píng)估負(fù)載 ASO 的 MMOF 的治療效果。治療 8 周后，接受磁引導(dǎo)、ASO 負(fù)載 MMOF 治療的小鼠軟骨降解和軟骨下骨硬化顯著緩解。在沒有磁場(chǎng)的情況下，骨關(guān)節(jié)炎OARSI評(píng)分和軟骨下骨硬化有細(xì)微的改善（圖4 E-G）。FISH 染色結(jié)果證實(shí)，單獨(dú)負(fù)載 ASO 的 MMOF 治療略微降低了骨細(xì)胞 H19 在軟骨下骨區(qū)域的分布，而一旦與磁場(chǎng)結(jié)合，觀察到對(duì) H19 陽(yáng)性骨細(xì)胞的顯著抑制（圖4 E、H）。暴露于磁場(chǎng)后，MMOF 注射顯著降低 OA 軟骨下骨細(xì)胞中 COX-2、OPG 和 DMP1 的表達(dá)。

圖4   MMOF 的體內(nèi)治療。

圖5   圖形概要

總之，這項(xiàng)結(jié)果提供了新的證據(jù)，表明骨細(xì)胞中 H19 表達(dá)升高可能導(dǎo)致異常的軟骨下骨重塑和 OA 進(jìn)展。H19 似乎是骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)所必需的，靶向 H19 代表了 OA 治療的一種新的有前途的方法。

參考文獻(xiàn)：Wang R, Mehrjou B, Dehghan-Banian D, Wang BYH, Li Q, Deng S, Liu C, Zhang Z, Zhu Y, Wang H, Li D, Lu X, Cheng JCY, Ong MTY, Chan HF, Li G, Chu PK, Lee WYW. Targeting Long Noncoding RNA H19 in Subchondral Bone Osteocytes and the Alleviation of Cartilage Degradation in Osteoarthritis. Arthritis Rheumatol. 2024 Oct 31. doi: 10.1002/art.43028. Epub ahead of print. PMID: 39482250.

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