視網膜色素上皮層（RPE）在維持視網膜穩態和支持視網膜細胞（如感光細胞）方面起著關鍵作用。當 RPE 受損時，可能導致多種視網膜疾病，包括年齡相關性黃斑變性（AMD）。RPE 的損傷可由多種因素引起，如吸煙、暴露于紫外線和可見光。這些條件會產生活性氧（ROS），并誘導視網膜的氧化應激。線粒體功能障礙在 AMD 中起關鍵作用，研究表明，隨著 AMD 進展，RPE 中的線粒體 DNA 損傷增加，進而導致細胞功能障礙和視網膜退化。

核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）是一種關鍵的轉錄因子，調節細胞對氧化應激的防御能力。在 RPE 細胞中，Nrf2 的激活對防止氧化損傷尤為重要，氧化損傷是視網膜退行性疾病發病機制的重要因素。通過增強抗氧化反應，Nrf2 維持 RPE 細胞的功能完整性，從而在視覺功能中發揮保護作用。考慮到氧化應激在視網膜疾病中的核心作用，理解 RPE 細胞中 Nrf2 的調控可能為預防或治療 AMD 等疾病的治療策略提供寶貴見解。

鑒于 RPE 細胞對 AMD 氧化應激的易感性，針對氧化損傷和炎癥的治療方法至關重要。其中一種方法是使用色素上皮衍生因子（PEDF），該因子可在人體胎兒 RPE 細胞培養的條件培養基中鑒定。PEDF 可以保護神經元免受氧化應激和谷氨酸毒性的影響，在視網膜細胞中，它還能增加 AMD 患者抗氧化蛋白的表達。此外，PEDF 因其抗血管生成作用，可以抑制與 AMD 相關的脈絡膜新生血管形成（CNV），證實了其治療 AMD 的潛力。

以往研究已報告了胎盤來源的間充質干細胞（PD-MSCs）促進guoyanghuaqing（H2O2）-誘導的大鼠視網膜中視網膜層的恢復。最近，韓國 CHA 大學生命科學系、生物醫學系及醫療中心眼科團隊在一項研究中旨在比較 PD-MSCs 與具有已知治療潛力的 PEDF 因子的治療效果，并探討 PD-MSCs 是否能激活 H2O2-損傷的人視網膜色素上皮細胞（ARPE-19）中的 Nrf2，從而發揮抗氧化作用。研究成果發表于 Antioxidants  期刊題為“Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line"。

為了探索 PD-MSCs 對 ARPE-19 細胞中誘導的氧化應激的影響，將 ARPE-19 細胞用guoyanghuaqing（H2O2）處理，并與初始 PD-MSCs 共培養。首先，分析了與 PD-MSCs 共培養的 ARPE-19 細胞中 PEDF 的 mRNA 表達。與對照組相比，H2O2 處理顯著降低了 PEDF mRNA 水平，而與 PD-MSC 共培養則阻止了 H2O2誘導的降低（圖1 A）。

RPE 細胞中的脂質代謝在維持與光感受器細胞的通訊中起著關鍵作用。然而，氧化應激可干擾脂質代謝，從而損害相關調控因子的正常功能。與脂蛋白相關的 ABCA1 和 ApoE 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中有所增加，但在 PD-MSC 共培養組中顯著減少（圖1 B、C）。脂質過氧化產物丙二醛（MDA）水平在 H2O2 處理組中上升，但在 PD-MSC 共培養組中顯著減少（圖1 D）。代表性圖像顯示出與 ABCA1 mRNA 表達相同的趨勢（圖1 E、F）。

為驗證脂滴形成，通過 BODIPY 染色分析 ARPE-19 細胞，發現由 H2O2 處理增加的脂質形成在與 PD-MSC 共培養后顯著減少（圖1 G、H）。這些結果表明，PD-MSCs 抑制 H2O2 損傷的 ARPE-19 細胞中脂蛋白的形成。

圖1    PD-MSCs共培養減少H2O2暴露的ARPE-19細胞中的脂質積累。

抗氧化作用對于在氧化應激環境中維持視網膜穩態至關重要。特別是，超氧化物歧化酶（SOD）、guoyanghuaqing酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化物氧化還原酶（Prx）是線粒體和過氧化物酶體中的關鍵抗氧化酶（圖2 A）。接下來，為了分析 ARPE-19 細胞中的 mRNA 水平，培養并采集了下腔室的細胞，發現與 H2O2 處理組相比中，HO-1、SOD1、guoyanghuaqing酶、GPx1 和 Prx3 的 mRNA 表達在 PD-MSC 共培養組中顯著增加（圖2 B-F）。HO-1、SOD1、guoyanghuaqing酶和 Prx3 的蛋白質水平與 mRNA 表達呈相同趨勢（圖2 G）。

為確認 ARPE-19 細胞中內源性 SOD1 和guoyanghuaqing酶水平，隨后分析了 ARPE-19 細胞的培養上清液。這些參數在 H2O2 處理組降低，但在 PD-MSC 共培養組中顯著增加（圖2 H、I）。

為分析 PD-MSCs 是否影響線粒體氧化應激，使用 MitoSOX 染色檢測 ARPE-19 細胞中的線粒體超氧化物 ROS 水平，發現線粒體 ROS 活性在 H2O2 處理組上升，但在 PD-MSC 共培養組中減少（圖2 J、K）。這些結果表明，PD-MSCs 通過增強抗氧化作用來緩解氧化應激。

圖2     PD-MSCs共培養通過增qiangbao露于H2O2的ARPE-19細胞中的抗氧化劑積累來減輕氧化應激。

線粒體動力學是線粒體循環的重要機制，包括“融合"和“分裂"。線粒體融合蛋白1/2（MFN1/2）和視神經weisuo蛋白1（OPA1）與線粒體融合相關。動力蛋白相關蛋白1（DRP1）和分裂蛋白1（FIS1）與線粒體分裂相關（圖3 A）。FIS1 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中有所升高，但在 PD-MSC 共培養組中升高幅度更大（圖3 B）。DRP1、MFN1/2 和 OPA1 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中減少，但在 PD-MSC 共培養組中顯著增加（圖3 C-F）。代表性圖像顯示出與 OPA1 mRNA 表達相同的趨勢（圖3 G、H）。

線粒體膜電位是線粒體能量儲存和活性的關鍵指標。為分析 PD-MSCs 是否能增加線粒體膜電位，在 ARPE-19 細胞中進行了 JC-1 染色，發現 H2O2 處理組中聚集體和單體 JC-1 的比例下降，但 PD-MSC 共培養組中顯著增加（圖3 I、J）。這些數據表明，PD-MSC 共培養通過調節 H2O2 暴露的 ARPE-19 細胞的線粒體動力學來增強線粒體膜電位。

RPE 與光感受器細胞之間的視覺循環對與維生素A 相關的視覺過程至關重要。暴露于氧化應激的 RPE 細胞會發生細胞凋亡，并表現出視覺循環的下調。為驗證與 PD-MSCs 的共培養是否能調控這些變化，進行了 Caspase-3 和 RPE65 的免疫熒光染色。切割后 Caspase-3 的表達在 H2O2 處理組顯著增加，但在 PD-MSC 共培養組減少。然而，RPE65 的表達則呈現相反趨勢。RDH11 和 RPE65 的蛋白質水平在 H2O2 處理組中下降，但在 PD-MSC 共培養組中有所增加。這表明，PD-MSC 共培養改善暴露于 H2O2 的 ARPE-19 細胞的視覺循環。

圖3     PD-MSCs共培養通過調節暴露于H2O2的ARPE-19線粒體動力學來增強線粒體膜電位。

最后，為分析抗氧化酶關鍵調控因子 Nrf2 的激活，在 mRNA 表達水平上評估了 PI3K/AKT 信號通路（Nrf2的上游調控通路）。此外，還調查了 PEDF 是否能激活這一機制。

PI3K p110α 的 mRNA 表達在 H2O2 處理組中減少，但在 PD-MSC 共培養組中顯著增加。與 H2O2 處理組相比，單獨 PEDF 處理顯著提高了 PI3K p110α 的表達，但與 PD-MSC 共培養組相比差異并不顯著。然而，PD-MSCs 與 PEDF 的聯合處理顯著提高了 PI3K p110α 的表達（圖4 A）。單獨使用 PEDF 處理并未顯著增加 AKT 的表達，但是在僅與 PD-MSCs 共培養以及在 PD-MSCs 和 PEDf 聯合培養的細胞中，其上調顯著（圖4 B）。Nrf2 的 mRNA 表達與 AKT 呈相同趨勢（圖4 C）。PI3K p110α、AKT 和 Nrf2 的蛋白質水平在 H2O2 處理組下降，但在 PD-MSC 共培養組中有所增加。此外，KEAP1 在 H2O2 處理組中表達升高，但當細胞與 PD-MSCs 共培養時，其水平趨于下降，而 Nrf2 表達則觀察到相反的模式（圖4 D-H）。

為確定 Nrf2 活化與其主要負調控因子 KEAP1 之間的相關性，進行了免疫染色。H2O2 處理后 Nrf2 表達略有增加，但統計學上無顯著差異。隨后，與 PD-MSCs 的共培養顯著提升了 Nrf2 表達。以 KEAP1 為例，其表達在 H2O2 處理后沒有顯著變化，但與 PD-MSCs 共培養時表現出輕微下降。在 PD-MSC 共培養條件下，KEAP1 表達與 Nrf2 表達呈負相關（圖4 I-L）。這些結果表明，PD-MSC 共培養激活暴露于 H2O2 的 ARPE-19 細胞中的 Nrf2 信號通路。

圖4     PD-MSC共培養激活H2O2暴露的ARPE-19細胞中的Nrf2信號通路。

圖5    PD-MSCs 通過Nrf2通路增加抗氧化酶對H2O2損傷的RPE的治療作用概述。PD-MSCs通過PI3K/AKT信號通路激活Nrf2，促進抗氧化酶的表達。線粒體動力學受到調控，導致線粒體活性氧水平降低，線粒體膜電位穩定。RPE再生隨著脂蛋白積累和細胞凋亡減少得到增強。

總之，該研究證明：H2O2 增加 ARPE-19 細胞中的線粒體 ROS 水平，導致線粒體功能障礙，還通過脂質過氧化和積累誘導細胞凋亡；PD-MSCs 激活 Nrf2，增加抗氧化劑表達，改善線粒體功能，減少脂質過氧化和積累，還可以通過 PI3K/AKT 信號通路調控 Nrf2。即 PD-MSCs 通過 Nrf2 介導的抗氧化機制來促進 H2O2 損傷的 ARPE-19 細胞的恢復。然而，PEDF 在這一過程中的直接作用仍不明確，需在各種實驗條件下進一步研究。未來還需闡明 PEDF 調節視網膜修復的分子機制，并探索其與 PD-MSCs 的潛在協同效應。

參考文獻：Hong SJ, Lee DH, Choi JW, Lee H, Sung Y, Kim GJ. Nrf2 Activated by PD-MSCs Attenuates Oxidative Stress in a Hydrogen Peroxide-Injured Retinal Pigment Epithelial Cell Line. Antioxidants (Basel). 2025 Oct 25;14(11):1279. doi: 10.3390/antiox14111279. PMID: 41300437; PMCID: PMC12649114.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41300437/或點擊閱讀原文