牙髓干細胞（DPSCs）分泌血管生成因子，如 VEGF，以促進 EC 增殖和遷移，啟動新血管形成，并逐步作為周細胞提供結構支持并穩定新生血管。然而，參與微調新生血管芽和血管穩定的各種促血管生成和抗血管生成的因素尚未wanquan理解。以往研究表明，與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的直接接觸培養會推動 DPSC 向平滑肌細胞（SMCs）的分化，在此過程中，轉化生長因子-β1（TGF-β1）的上調至關重要。有趣的是，屬于 TGF-β 超家族的激活素A（Activin A）在 DPSC-HUVEC 共培養中也顯著增加，并在第6天達到峰值。然而，其在 DPSC-HUVEC 共培養過程中調控血管生成的作用仍然難以確定。

Activin A 是一種多功能細胞因子，參與多種生物過程，包括胚胎發育、細胞增殖與分化、免疫反應調節以及傷口愈合。Activin A 通過上調其血管內皮生長因子受體1（VEGFR1）來抑制 HUVEC 增殖和血管生成，該受體是 VEGF 的誘餌受體，從而減少 VEGFR2 的活化及隨后的 EC 血管形成。由于 DPSCs 與 HUVECs 的直接相互作用重現血管生成過程并誘導 Activin A 的分泌，有理由假設 Activin A 可能參與 DPSC-HUVEC 共培養中成熟且穩定的微血管網絡形成。

基于此，香港大學牙醫學院修復牙科學聯合廣州市口腔再生醫學基礎與應用研究重點實驗室團隊在一項研究中利用體外 DPSC-HUVEC 共培養模型，探討了 Activin A 表達的動態模式及其在調控細胞功能中的作用。研究證明 DPSC-HUVEC 共培養顯著促進 Activin A 的分泌，Activin A 未影響 DPSC 向 SMCs 的分化，但破壞 HUVECs 中 VEGF 受體的平衡，抑制 HUVEC 新生血管芽并增強血管穩定。這些發現揭示了在血管形成和穩定過程中，HUVECs 與 DPSCs、Activin A 和 VEGFR1/2 之間的關鍵旁分泌串擾，這可能成為加速牙髓血管形成和再生的分子靶點。研究成果發表于 The International Endodontic Journal 期刊題為“Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells"。

首先，ELISA 表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接共培養中 Activin A 分泌顯著增加，而在 DPSCs 或 HUVECs 單培養中水平極低（圖1 a）。與單培養相比，D+E 共培養中激活素結合蛋白——卵泡抑素（Follistatin）的分泌下調且基因表達降低，INHBA 基因表達上調（圖1 b-d）。VEGF 的分泌模式與 Activin A 相反。在早期和晚期，D+E 共培養的 VEGF 濃度顯著低于 DPSC 單一培養，甚至無法檢測到（圖1 e）。相比之下，D+E 共培養中的 VEGF 基因表達在共培養后第1天和第6天保持升高（圖1 f）。為驗證 DPSCs 與 HUVECs 直接共培養對 Activin A 分泌的必要性，將兩者進行間接共培養，結果顯示 DPSC 或 HUVEC 單培養與 D+E 間接共培養在 Activin A 分泌上無差異（圖1 g）。這些數據表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接接觸共培養會誘導 Activin A 分泌。

為評估 D+E 共培養中 Activin A 的分泌是否介導 DPSC 向 SMCs 的分化，將其與 DPSCs 共處理6天。結果顯示，DPSCs 用 Activin A（25、50和100 ng/mL）處理后，盡管 RNA 水平變化輕微或無顯著變化，但未引起 SMC 特異性標志物（α-SMA、Calponin 1和SM22α）蛋白水平的顯著變化，這說明 Activin A 不影響 DPSC 分化為 SMCs 的過程。

圖1    Activin A在牙髓干細胞（DPSC）單培養、人類臍靜脈內皮細胞（HUVECs）單培養和DPSC+HUVEC共培養中的表達和分泌。

接下來，為探討 Activin A 對血管生成反應的影響，HUVECs 在指定時間點用 Activin A（100 ng/mL）處理。CCK-8結果顯示，與對照組相比，Activin A 顯著減少了 HUVEC 增殖，相比之下，與 VEGF 聯合處理顯著消除了抑制作用（圖2 a）。劃痕實驗評估 HUVECs 的遷移過程，發現 Activin A 對 HUVEC 遷移具有抑制作用，相比之下，VEGF 刺激顯著增強了遷移率，而 Activin A 抑制了 VEGF 誘導的 HUVEC 遷移（圖2 b）。Matrigel管形成分析顯示，Activin A 抑制 HUVEC 管形成能力，與 VEGF 聯合處理可以通過增強分支數和總管長來逆轉 Activin A 的作用（圖2 c）。在3D球體出芽試驗中，Activin A 預處理的 HUVEC 球體較對照組發芽長度減少約18.9%。此外，VEGF 誘發的發芽也被 Activin A 共處理顯著抑制（圖2 d）。與功能實驗檢測一致，血管生成激活標志物 vWF 和 CD31 的 mRNA 和蛋白表達在 Activin A 處理后顯著抑制（圖2 e、f）。總體而言，Activin A 刺激降低了 HUVEC 血管生成能力，部分逆轉了 VEGF 的促血管生成效應，表明其可能在 VEGF 介導的血管生成中起關鍵作用。

為了解 DPSCs 與 HUVEC 相互作用如何通過自分泌或旁分泌機制影響血管生成反應，隨后分析了暴露于 DPSC 單培養或 D+E 共培養的 CM 中 HUVEC 功能反應。結果顯示，培養3天后，D+E-CM 顯著降低了 HUVEC 增殖，且劃痕愈合速度顯著慢于對照組。為探究 Activin A 是否與 D+E-CM 對 HUVEC 增殖和遷移的抑制作用有關，將 HUVEC 暴露于添加 Activin A 中和抗體（IgG）的 D+E-CM 中，發現細胞增殖和細胞遷移均增加，也增強了 HUVEC 管形成的能力，同時抵消了 HUVEC 暴露于 D+E-CM 導致的發芽長度顯著減少這一效應。血管生成標志物的表達與這些功能結果一致，D+E-CM 對 vWF 和 CD31 表達的抑制作用在 Activin A 中和后被部分逆轉。

圖2     在用Activin A處理后，HUVECs的血管生成功能。

共培養中編碼 VEGFR1 的 FLT-1（FMS樣酪氨酸激酶1）基因的表達在第6天進行了評估（圖3 a），發現在 D+E 共培養中，可溶性（s）和膜結合型（m）形式的 FLT-1 均顯著增加，且主要在 HUVEC 中表達。與 qRT-PCR 結果一致，D+E 共培養中 VEGFR1 分泌迅速增加（圖3 b）。

為探究 D+E-CM 是否介導 D+E 共培養中 FLT-1 的上調，在有或無 IgG 的預孵育下在 D-CM 或 D+E-CM 中培養 HUVEC 48 小時，發現暴露于 D-CM 會略微降低 sFLT-1 和 mFLT-1 表達（圖3 c），D+E-CM 暴露使 FLT-1 分泌增加4.8倍（圖3 d）。相比之下，中和抗體 IgG 部分消除了 D+E-CM 對 FLT-1 表達的刺激效應。

為進一步評估升高的 FLT-1 是否消耗了共培養過程中產生的大部分 VEGF，在與 DPSCs 共培養之前，用靶向 FLT‐1 （si‐FLT‐1）或 si‐NC 的 siRNA 轉染 HUVECs，共培養6天后，ELISA 結果顯示，與轉染 si-FLT-1 的 HUVECs 共培養的 DPSCs 的 VEGF 濃度是對照組的1.56倍，這表明 HUVECs 中 FLT-1 的增加是共培養過程中 VEGF 耗竭的原因（圖3 e）。

用 Activin A 刺激 HUVECs 在第3天顯著上調了 FLT-1 表達。相比之下，編碼 VEGFR2 mRNA 的 KDR 僅略有增加（圖3 f）。Activin A 誘導了 HUVECs 中 VEGFR1/VEGFR2 mRNA 高比值。與 mRNA 表達一致，Activin A 在兩個時間點均顯著提升了 HUVECs 中 sFLT-1 分泌（圖3 g），還提高了 VEGFR1 蛋白的表達（圖3 h）。這些研究表明，Activin A 的抗血管生成效果部分源于其提升 VEGFR1/VGEFR2 表達比值的能力。

為進一步研究 Activin A 處理是否抑制 VEGF 誘導的 VEGFR2 激活，HUVECs 先用重組 Activin A 預處理48小時，隨后用 25 ng/mL VEGF 刺激15分鐘，發現 VEGF 處理顯著增強 VEGFR2 的磷酸化，而 VEGF 誘導的 VEGFR2 磷酸化在 Activin A 預處理的 HUVEC 中降低（圖3 i）。高濃度的 VEGFR1 主要通過與 VEGFR2 競爭性地結合在 VEGF 上作為 VEGF 誘餌，阻止 VEGF/VEGFR2 信號的激活。

圖3      DPSC-HUVEC共培養和Activin A處理的HUVEC中VEGF受體的表達。

為確定導致 D+E-CM 中 Activin A 增加的細胞，收集共培養細胞并用 Dynabeads CD31 分離，將分離的 DPSCs 復制培養收集 CM，同時單培養的 DPSC 進行相應的復制。與 HUVECs 共培養的 DPSCs CM 中 Activin A 的分泌水平遠高于 DPSCs 單培養。與 DPSC 單培養相比，INHBA 在分離 DPSCs 中的 RNA 表達也有所增強。此外，從 D+E 直接共培養分離的 DPSCs 中，Activin A 的蛋白表達高于 DPSC 單培養和 D+E 間接共培養中的 DPSCs。這些結果表明，在 DPSC-HUVEC 共培養中主要是 DPSCs 分泌 Activin A ，且細胞間直接接觸培養對于觸發 DPSCs 中的 Activin A 分泌至關重要。

最后，為了調查 Activin A 是否參與 DPSC-HUVEC 共培養中血管穩定，在血管網絡形成后，將 sh-NC 轉染的 DPSCs 或 INHBA 敲低的 DPSCs 播種到基質上。結果顯示，NC-DPSC 播種后，原有管狀網絡的分支點合并形成更大更厚的管狀結構，NC-DPSCs 緊緊包裹著管狀結構（圖4 a）。相比之下，添加 INHBA 敲低的 DPSC 使血管樣結構的厚度和連接面積相比 NC‐DPSC‐seeded 組減少，說明敲低 Activin A 會抑制血管穩定性。此外，當 HUVECs 與 INHBA 敲低的 DPSCs 共培養時，血管樣網絡的穩定性被破壞，這表明 Activin A 在穩定預形成血管結構中的重要性。

圖4     添加NC-DPSC和Activin A敲低DPSC后，穩定已有的血管樣結構。

綜上所述，Activin A 在 DPSC-HUVEC 共培養過程中介導血管形成和穩定，發揮重要作用。Activin A 通過增強 VEGFR1 表達，減少 VEGFR2 的磷酸化，微調 VEGF 活性，從而抑制 HUVECs 的血管生成反應（圖4 b）。該研究拓展了我們對 HUVECs 與 DPSCs 之間旁分泌相互作用的理解，后者有望成為促進牙髓再生中血管組織工程的潛在分子靶點。

參考文獻：Zhong J, Zhang Y, Lin S, Kang J, Hu M, Liu J, Chen Y, Jiang Q, Zhang C. Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells. Int Endod J. 2025 Jul;58(7):991-1005. doi: 10.1111/iej.14226. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40106315; PMCID: PMC12160993.

原文鏈接：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40106315/或點擊閱讀原文

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