關鍵詞：重癥肌無力、MG、EAMG、實驗性自身免疫性重癥肌無力、動物造模、自身免疫性疾病

為什么你的EAMG模型總是不穩定？

重癥肌無力（Myasthenia Gravis, MG）是一種以肌肉無力為主要特征的自身免疫性疾病。實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）作為研究MG發病機制和評估新療法的核心動物模型，已有超過50年的應用歷史。然而，一個長期困擾研究者的難題始終存在：模型誘導成功率低、個體差異大、重復性差。

抗原來源不同、佐劑劑量不一、注射部位隨意——這些看似細微的差異，往往決定了實驗的成敗。正如南京中醫藥大學團隊在《International Journal of Molecular Sciences》最新發表的研究中所指出的：EAMG模型誘導長期以來缺乏標準化方案，嚴重制約了藥物篩選和機制研究的可重復性。

好消息是，這一問題終于有了系統性的解決方案。

一、痛點直擊：傳統EAMG造模的三大“坑"

坑1：動物品系選不對，努力全白費

C57BL/6小鼠雖是免疫學研究的“標配"，但在EAMG造模中卻常常“不給力"。研究發現，即便使用優化的免疫方案，C57BL/6小鼠的臨床評分普遍低于2分（滿分4分），RNS陽性率不足50%，且小鼠體型小導致采血困難、注射部位難以操作。此外，C57BL/6小鼠攻擊性強，同籠打斗嚴重影響實驗后期動物狀態。

坑2：抗原佐劑“差不多就行"，結果差很多

傳統方案常用50 μg AChR肽 + 1 mg H37Ra，但這一組合在Lewis大鼠中往往不足以誘導穩定的肌無力癥狀。癥狀出現晚（15-20天）、臨床評分低（多低于2分），模型成功率大打折扣。

坑3：注射部位隨意選，藥物吸收成問題

皮下注射后形成硬結、藥物吸收不良，是EAMG造模中最常見卻又最容易被忽視的問題。乳化時間過長導致乳劑過稠、注射部位過少導致局部藥物堆積——這些細節直接決定了免疫應答的強度。

二、解決方案：四大優化維度，讓EAMG造模從“玄學"變“科學"

南京中醫藥大學團隊通過系統的單變量對照實驗，在Lewis大鼠和C57BL/6小鼠中逐一驗證了關鍵參數的影響，最終形成了一套高成功率、高重復性的標準化方案。

優化1：動物選擇——Lewis大鼠是shou選

結論：Lewis大鼠是EAMG造模的優選品系。

優化2：抗原佐劑劑量——加量不加“傷"

通過對比50 μg與75 μg AChR肽、1 mg與2 mg H37Ra的配伍效果，研究得出明確結論：

• AChR肽：75 μg > 50 μg。75 μg組臨床評分更高、癥狀出現更早（約第10天），部分大鼠評分可達3分以上（滿分4分），而50 μg組多數評分低于2分。

• H37Ra：2 mg > 1 mg。2 mg組AChR抗體水平顯著升高，提示更強的免疫應答。

推薦方案：75 μg AChRα97-116肽 + 2 mg H37Ra（shou次免疫，CFA為佐劑）。

優化3：乳化與注射——細節決定成敗

乳化時間影響有限，但注射部位至關重要！

• 乳化時間：15分鐘與60分鐘的乳化時間對體重、臨床評分和炎癥因子水平無顯著影響，但短時間乳化可減少皮下結節形成。

• 注射部位增加足墊注射：包含足墊注射的組別癥狀出現更早、臨床評分更高、RNS衰減率更大、AChR抗體水平更高。

推薦操作：

• 使用無橡膠活塞的注射器進行乳化，減少熱量產生，保護抗原完整性。

• 大鼠皮下注射使用22G針頭，小鼠及足墊注射使用25G針頭。

• 增加背部注射位點 + 納入足墊注射，顯著改善藥物吸收。

• 注射后輕柔按壓，定期觀察，必要時使用碘伏消毒和紅霉素軟膏預防感染。

優化4：術后護理——小細節，大不同

• 注射后按摩和熱敷可促進藥物吸收、減少持續性結節形成。

• 將總劑量分散至更多注射位點、減少每點位注射體積，可降低結節形成風險。

三、標準化造模方案（完整操作流程）

基于上述優化，我們整理出經過驗證的EAMG標準化造模方案：

【材料清單】

【免疫方案】

shou次免疫（第0天）：

• 配制200 μL乳劑：100 μL PBS（含75 μg AChR肽）+ 100 μL CFA（含2 mg H37Ra）

• 皮下多點注射：肩部、背部、尾根部

• 建議納入足墊注射

加強免疫（第30天）：

• 配制200 μL乳劑：100 μL PBS（含75 μg AChR肽）+ 100 μL IFA（不含H37Ra）

• 注射部位同shou次免疫

四、模型評價體系：四大維度全面驗證

成功造模后，需要通過多維度指標進行驗證。通常采用臨床評分 + RNS + ELISA的組合評價體系。

維度1：Lennon臨床評分（核心指標）

• 判定標準：臨床評分 > 2分為造模成功。

• 操作要點：將動物置于光滑表面，連續觀察約2分鐘，根據活動能力評分。若臨床表現介于兩級之間，可加0.5分。

維度2：重復神經電刺激（RNS）

• 方法：第45天進行RNS測試。將針灸針作為電極，插入坐骨神經附近肌肉、腹部皮下、跟腱和腓腸肌內側頭。

• 刺激參數：3 Hz和5 Hz，每組10個脈沖，共3組。

• 計算：衰減率D = [（第1個波幅 - 第5個波幅）/ 第1個波幅] × 100%

• 判定標準：D值 > 10%為陽性，提示肌力受損。

維度3：血清AChR抗體檢測（ELISA）

• 采血：第45天尾尖采血，室溫靜置30 min，3000 rpm、4℃離心15 min取血清。

• 檢測：ELISA法檢測抗AChR 97-116抗體滴度。

• 判定標準：模型組AChR-Ab水平顯著高于對照組。

維度4：炎癥因子檢測

• 指標：IL-4、IFN-γ、IL-17等促炎因子。

• 方法：ELISA法檢測血清炎癥因子水平。

• 判定標準：模型組炎癥因子水平顯著上調。

【綜合評價標準】

造模成功 = 臨床評分 > 2分 + RNS衰減率 > 10% + AChR-Ab水平顯著升高。

五、方案優勢總結

六、應用場景與價值

這套標準化EAMG造模方案可廣泛應用于：

1. 藥物篩選：評估免疫抑制劑、單克隆抗體、補體抑制劑等候選藥物的療效。

2. 機制研究：探索AChR抗體介導的自身免疫損傷機制。

3. 新療法驗證：從B細胞耗竭療法到FcRn抑制劑，EAMG是臨床前研究的金標準模型。

4. 中藥研發：評估中藥復方對自身免疫性疾病的調節作用。

EAMG模型不穩定的時代正在過去。南京中醫藥大學團隊通過系統的單變量優化研究，用數據告訴我們：標準化不是限制，而是解放——讓研究者從“碰運氣"的造模中解脫出來，把精力真正投入到科學問題本身。

核心方案速記：雌性Lewis大鼠 + 75 μg AChRα97-116肽 + 2 mg H37Ra/CFA + 多點皮下注射（含足墊）+ 第30天加強免疫 + 臨床評分/RNS/ELISA多維評價 = 高成功率EAMG模型

參考文獻：

[1] Zhang X, Bai Y, Wang S, Shi J, Wu H. Optimization of Induction Protocols for Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4628. Published 2025 May 12. doi:10.3390/ijms26104628.

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