外泌體（Exosome）作為直徑30–150nm的細胞外囊泡，攜帶蛋白質、miRNA、mRNA及脂質等生物活性分子，是細胞間通訊的重要載體，在腫瘤轉移、免疫調控、干細胞治療、液體活檢等領域均是研究熱點。然而，許多科研人員在開展外泌體相關實驗時，常常遭遇NTA定量偏高、WB標志物出現雜帶、測序結果混入異種核酸、平行實驗重復性差等問題。排查一圈后才發現，問題并非出在提取方法或操作手法，而是細胞培養體系中最基礎的添加劑——胎牛血清（FBS）本身就攜帶著大量牛源外泌體，成為實驗數據失真的核心內源干擾源。

一、為什么外泌體實驗總做不準？血清內源囊泡是隱形干擾源

常規胎牛血清取自健康胎牛血液，牛體內各類細胞會持續向外周血液分泌大量囊泡。在傳統血清制備流程中，僅進行除菌過濾，并無專門去除外泌體的工藝步驟，因此成品血清中天然富含牛源細胞外囊泡。據文獻報道，普通胎牛血清中外泌體顆粒濃度可達10⁹–10¹⁰particles/mL級別，攜帶CD9、CD63、TSG101等經典外泌體標志物以及大量牛源miRNA。

當研究者用含普通血清的wan全培養基培養細胞并收集上清提取外泌體時，最終得到的樣本實際上是"細胞分泌外泌體+血清本底牛源外泌體"的混合物。這種混合體會從多個維度干擾實驗結果：

• 1、定量層面：NTA納米顆粒跟蹤分析會將牛源囊泡一并計入，導致顆粒數顯著偏高，無法準確反映細胞真實的外泌體分泌量。

• 2、蛋白層面：Western Blot檢測CD63、CD81等標志物時，會出現血清來源的雜帶，影響目的條帶的灰度定量；蛋白質譜分析則會混入大量牛源白蛋白、免疫球蛋白等高豐度蛋白，掩蓋細胞來源的低豐度功能蛋白。

• 3、核酸層面：牛源外泌體攜帶的miRNA、mRNA會污染測序文庫，造成轉錄組數據背景噪音大、差異基因篩選失真，尤其在進行miRNA測序、circRNA分析時影響更為顯著。

• 4、功能層面：血清外泌體本身具有生物學活性，可促進細胞增殖、遷移、抗凋亡，在開展外泌體功能獲得/缺失實驗時，會造成假陽性結果，嚴重干擾機制解讀。

發表于Journal of Extracellular Vesicles的研究指出，18小時超速離心方案可去除胎牛血清中約95%含RNA的細胞外囊泡，并顯著降低血清囊泡對上皮細胞遷移的促進作用，從實驗層面證實了血清內源囊泡的功能干擾效應。

二、什么是無外泌體胎牛血清？定義與制備工藝詳解

無外泌體胎牛血清（Exosome-Depleted FBS）是專為外泌體研究開發的特種細胞培養血清，以優質胎牛血清為原料，通過多級物理去除工藝最大限度清除內源牛源囊泡，同時完整保留生長因子、氨基酸、激素、維生素等細胞增殖必需的營養組分，兼顧培養性能與實驗純凈度。

主流制備工藝采用"超速離心+納米過濾"聯合方案，核心流程如下：

• 第一步：原料篩選。選用來源清晰、無瘋牛病（BSE）風險區域的健康胎牛血清，經初篩確保內毒素、血紅蛋白、總蛋白等基礎指標達標。

• 第二步：多級超速離心。將血清稀釋后置于超速離心機中，以100,000×g以上的相對離心力連續離心18小時左右，利用密度差異使外泌體等納米級囊泡沉降至管底，棄去沉淀，收集上層澄清血清。超速離心是目前認可的外泌體去除金標準方法，Shelke等人的對比研究證實，18小時離心時長在去除效率與營養保留之間達到最佳平衡。

• 第三步：納米級終端過濾。離心后的上清依次通過0.22μm、0.1μm乃至更小孔徑的無菌濾膜，進一步截留殘余囊泡顆粒與微生物，實現除菌與除囊泡雙重目的。

• 第四步：質控與分裝。成品需通過NTA顆粒濃度檢測、CD63蛋白定量、細胞增殖驗證、支原體檢測、內毒素檢測等多重質控，合格后無菌分裝凍存。

以愛必信無外泌體胎牛血清為例，由無菌采集健康胎牛血清過濾而成，外泌體經典標志物CD63含量可降至3.125pg/mL以下，內源外泌體去除率達96%以上。

三、無外泌體胎牛血清vs普通胎牛血清：核心差異在哪里？

很多研究者會擔心：去除了這么多囊泡，會不會影響細胞生長？實際上，二者的基礎營養組分高度一致，核心區別僅集中于外泌體含量與實驗適配性，細胞常規培養性能并無本質差異。

簡言之，無外泌體胎牛血清只"減去"了干擾實驗的囊泡，不"損失"細胞需要的營養。對于不涉及外泌體檢測的常規細胞培養，普通血清夠用；但只要實驗終點涉及外泌體的分離、鑒定、組學或功能研究，無外泌體血清就是剛需配置。

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參考文獻

1.Shelke GV, et al. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3: 24783.

2.Lobb RJ, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4: 27031.

3.Patel GK, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2019, 8(1): 1422674.

4.Théry C, et al. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology, 2002, 2(8): 569-579.

5.Toxavidis V, et al. The dark side of foetal bovine serum in extracellular vesicle studies. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11(10): 12268.