1. 無菌條件下取新鮮臍帶，用DPBS漂洗凈血跡。
注：一般臍帶取得非無菌環境，可以稍微用75%酒精潤洗。

2. 置10 cm于培養皿中，剪成1~2cm臍段，剔除血管，用DPBS洗凈血跡，再剪成1 mm3組織塊。

圖1. 剔除臍帶3根動靜脈血管

3. 用無菌滴管吸取少量細小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個孔中。

4. 37℃，5% CO?培養箱孵育30min，以使組織塊粘貼在培養皿壁上。

5. 向每孔滴加0.8 ml wan全培養基（注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動組織塊）。

6. 37℃，5% CO? 培養箱孵育過夜，次日（D1）每孔再補加1 ml wan全培養基。

7. 37℃，5% CO? 繼續培養，5天（D6）后半量換液（此時一般看不到細胞，但最快3天就可看到細胞從組織邊沿爬出）。

8. 再過5天后半量換液（此時一般會有細胞爬出，但最晚可到14天會出現細胞從組織邊沿爬出）。

圖2. 細胞從組織塊邊沿爬出

圖3. 細胞快速增殖

圖4. 傳代時機成熟

9. 每2天換一次培養液，繼續培養2~4天，待細胞融度（Confluency）達到約80%后傳代培養。

注：組織塊培養的關鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動作要盡可能輕微，避免沖動組織塊。培養基加量不能太多，以免組織塊漂浮。

1、準備所需誘導分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，并用MSCwan全培養基重懸。

2、按照2×10?cells/cm2的密度將細胞接種于已包被處理的六孔板中，每孔MSCwan全培養基2ml，37℃、5% CO? 培養箱中培養。

3、當細胞融合達60%時，棄去培養上清，每孔添加MSC成骨誘導wan全培養基2ml/孔，37℃、5%CO?培養箱中培養。
注意：成骨誘導后細胞易脫壁，換液時wan全培養基必須經室溫復溫30分鐘。添加培養基時動作要輕柔，沿培養器皿側壁緩緩加入，切記避免吹起細胞。

4、每3天更換新鮮的MSC成骨誘導wan全培養基，持續培養2-4周。
注意：細胞狀態良好一般5天后培養液出現渾濁，不可與污染混淆，換液時盡量輕柔；7-10天左右出現鈣沉積。一般2周內出現較大的較厚的鈣沉積，透光性變差。有些細胞鈣沉積出現較晚，一般不超過3周，超過3周未出現明顯沉積，請注意分析操作步驟與其他原因?？筛鶕唧w實驗需求選擇終止時間，但不易超過4周。

5、誘導培養結束時，棄去培養上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室溫固定細胞20分鐘。

6、棄去固定液，DPBS洗2次，加入茜素紅染液1 ml/孔染色15分鐘。

7、棄去茜素紅染液，DPBS洗3次，添加新鮮DPBS。
注意：染色后肉眼可見孔內明顯染紅。染色過程中一定要避免組織細胞被風干，風干會影響顯微觀察效果。

8、顯微鏡下觀察并拍照。
注意：拍照一般選用高倍鏡，請根據需要確認選擇。

結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見紅色著色點，此處為鈣結節，說明實驗所用的MSC具有成骨能力。否則，所使用的MSC無成骨能力。

1、準備所需誘導分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，并用MSCwan全培養基重懸。

2、按照3×10?cells/cm2的密度將細胞接種于已包被處理的六孔板中，每孔MSCwan全培養基2ml，37℃、5%CO?培養箱中培養。

3、當細胞融合達90%時，棄去培養上清，每孔添加誘導液B 2 ml/孔，37℃、5%CO?培養。
注意：成脂誘導后細胞易脫壁，換液時wan全培養基必須經室溫復溫30分鐘。添加培養基時動作要輕柔，沿培養器皿側壁緩緩加入，避免吹起細胞。細胞起始誘導融合度對誘導效果十分關鍵，必須確保細胞生長至足夠密時再進行誘導。

4、誘導培養72 小時后棄去原培養上清，添加誘導液C 2 ml/孔，37℃、5%CO?繼續培養。

5、繼續誘導培養24 小時后棄去原培養基，添加誘導液B 2 ml/孔，37℃、5%CO?繼續培養。

6、重復步驟4、5約3-5次，待細胞內出現明顯脂滴時更換為誘導液C繼續培養。

7、一般在培養4天左右高倍鏡下能看到細胞漿內有較多數量的圓形亮泡，5-9天融合為較大的亮泡，這些結構圍繞在細胞核周圍，較大的與細胞核大小相當。狀態較好的細胞10天內可結束培養過程，若10天后仍未見脂滴結構，請注意分析操作步驟與其他原因。

8、每2天更換新鮮誘導液C，繼續培養至脂滴足夠大時培養結束。
注意：換液時誘導液必須經過復溫，否則影響誘導效果和可能導致細胞脫壁。根據實驗需要選擇培養結束時間，若成脂面積過大或脂滴過大導致連成片則不利于結果的呈現，建議提前終止。不同實驗室MSC誘導時出現脂滴的時間不盡相同，若大面積出現脂滴較早，則可提前更換為誘導液C。

9、誘導培養結束時，棄去培養上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2ml/孔室溫固定細胞20分鐘。

10、棄去固定液，DPBS洗2次，加入油紅O染液（工作液）1 ml/孔染色15分鐘。
注意：該步驟適用于鑒定成脂能力，若出現脂滴（脂肪細胞）則會呈現紅色著色。若需要得到美觀的圖片，則染色時間需自己掌握。

11、棄去油紅O染液（工作液），DPBS洗3次。
注意：油紅O染色必須配制成染色工作液，否則無法著色；染色工作液現配現用。染色后肉眼可見孔內明顯染紅。染色過程中一定要避免組織細胞被風干，風干會影響顯微觀察效果。

12、顯微鏡下觀察并拍照。
注意：拍照一般選用高倍鏡，請根據需要確認選擇。

結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見大面積紅色著色點，20倍和40倍鏡下可觀察到紅色球形在細胞內的情況，此紅色著色球為脂滴，說明實驗所用的MSC具有成脂能力。否則，所使用的MSC無成脂能力。
注意：該判定標準僅進行定性分析，若需要進行定量分析，需要自行制定方案。

1、準備所需誘導分化的MSC，當細胞融合達85%左右時，用消化液消化細胞，細胞沉淀用成軟骨誘導預混液重懸。

2、220 g離心5 分鐘，沉淀以預混液重懸，細胞密度約2×10? cells/ml，再次離心，棄上清。

3、沉淀以成軟骨誘導wan全培養基重新懸浮，調整細胞密度為2×10? cells/ml。

4、分別取500 μl 細胞懸液接種于15 ml離心管中，220 g離心5 分鐘。
注意：每管細胞的總數在5×10?至1×10?之間，一般以1個T25細胞培養瓶接種一個軟骨球為佳，細胞數過少形成的軟骨團塊較小，細胞數過多則可能會分開成塊。正常情況下可形成1-2 mm3的團塊。離心以細胞聚團為準，可適當調整。離心力過大，軟骨球不易懸浮，離心力過小則可能形成軟骨球效果不佳。

5、旋松離心管蓋，將離心管輕輕豎直置于37 ℃、5% CO?培養箱中靜置培養。
注意：24 小時內避免搖動細胞沉淀，以確保形成個團塊。離心管需使用聚丙烯材質無菌管。

6、誘導培養24 小時后，輕輕撥動離心管底，使細胞沉淀團塊懸浮，重新放回培養箱繼續培養。
注意：細胞團塊重新懸浮的時間因細胞而定，基本在24-48小時之間，以細胞團周圍有聚攏現象時為準。若細胞團塊貼壁較牢固，可用移液器輕輕吹動使其懸浮，注意不要吹散團塊。

7、每2天更換新鮮wan全誘導培養基。換液時輕輕吸去舊培養基，每管加新鮮配制的成軟骨分化wan全培養基500μl。
注意：換液時動作輕柔，以免吸出細胞團塊；誘導wan全培養基必須經過復溫，否則影響誘導效果。在誘導培養2-3 周后會出現大量細胞外基質，富含軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

8、誘導培養14-20天，棄去培養上清，DPBS洗細胞兩次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室溫固定細胞1小時。
注意：一般軟骨球誘導致密后能進行染色處理，時間在14-20天左右，時間過久可能導致團塊內部出現空泡，甚至團塊裂開，具體時間請以自己細胞的特性自行確定。

9、棄去固定液，DPBS洗團塊2次。

10、阿利新藍染色：向團塊中加500 μl阿利新藍染液染色30分鐘。棄染色液，加純水5 ml搖動清洗5分鐘/次，反復洗5次。
注意：染色液中的團塊不易看清，務必小心吸去上清，避免樣本丟失。

結果判定：按照程序操作完畢，低倍鏡下觀察可見深藍色著色，該藍色染色的為酸性粘多糖，說明實驗所用的MSC具有成軟骨能力。否則，所使用的MSC無成軟骨能力。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎入群交流哦！

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