一、  實驗前準備-全套試劑耗材

組織樣本處理-所用全套試劑耗材

二、  樣本取材及預處理

1、樣本取材

2、組織解離前預處理-肺臟

● 迅速取出完整肺臟

● 清洗修剪：立即置于預冷的組織保存液 或PBS中，仔細去除氣管、主支氣管及肺門周圍的脂肪和結(jié)締組織。

● 機械解離，用鋒利的眼科剪將其剪碎成 0.5-1 mm3 的小塊

三、  標準化組織解離步驟參考（以小鼠肺臟為例）

● 實驗思路框架

1、組織消化解離

(1)  酶消化：將組織塊（約100-200mg）轉(zhuǎn)移至離心管，加入 1 mL 組織解離液（難消化可延長）。

(2)  搖床孵育：將離心管置于 37℃恒溫水平搖床，以 80-100 rpm 的轉(zhuǎn)速孵育 30-40分鐘。

(3)  70μm 細胞篩網(wǎng)過濾，預冷 1×PBS 3-5mL 沖洗篩網(wǎng)；

(4)  4℃、300g 離心 5min，棄上清，4mL 40% Percoll 重懸沉淀；

2、Percoll密度梯度液配置（40%、80%、100%）

100% Percoll溶液：

Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合，配制等滲100% Percoll母液

40% Percoll溶液：

用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比4:6混合，配制40%等滲Percoll溶液。

80%Percoll溶液：

用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比8:2混合，配制80%等滲Percoll溶液。

3、Percoll 密度梯度提取目的細胞

(1)  建立密度梯度：用4mL 40% Percoll溶液重懸細胞沉淀。在另一15mL離心管底部預先加入2.5mL 80% Percoll溶液。然后，極其緩慢地 將40% Percoll細胞懸液沿管壁加在80% Percoll液面上，形成清晰界面。

(2)  離心：在 20℃、800×g （升速 1、降速 0）條件下離心 20分鐘

(3)  收集目標細胞：離心后，管中液體將分層。目標淋巴細胞和髓系細胞會集中在 40%與80% Percoll溶液的界面處，形成一層白色的云霧狀細胞層。小心地用吸管將該層細胞吸出，轉(zhuǎn)移至新管中。

(4)  加預冷 1×PBS，4℃、300g 離心 5min，棄上清；

(5)  細胞染色緩沖液重懸沉淀，備用。

4、細胞計數(shù)，活率測定&磁珠分選結(jié)果

● 取10-20μL細胞懸液，與等體積的 臺盼藍染液（0.4%） 混合

● 取適量混合液（通常10μL）加入計數(shù)儀專用的一次性計數(shù)載玻片

● 將載玻片插入儀器，自動分析細胞總濃度（cells/mL）、活細胞濃度和活率百分比

5、磁珠分選結(jié)果展示

四、小優(yōu)有妙計--新手避坑核心要點

1.  組織樣本如何延長保存時間？

盛有PBS或培養(yǎng)基的容器放冰上，采集的新鮮組織樣本直接放在里面短暫轉(zhuǎn)移處理；如需延長組織的保存時間可以用組織保存液abs9474-100mL（愛必信），4℃可保存48小時。

2.  什么情況下需要對組織樣本進行純化和預富集？

組織樣本包括免疫組織和非免疫組織。其中，免疫組織：胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等，免疫細胞占比高；非免疫組織：腫瘤、肝臟、肺臟、腸等，免疫細胞占比低。

當目標細胞在原始樣本中占比過低，或存在大量干擾物質(zhì)時，建議進行預富集，所以非免疫臟器最好過percoll，這是確保下游流式分析或分選實驗成功可靠的關鍵。

實驗所用試劑耗材