高效液相色譜儀的主要操作要點 你了解了嗎？

一、開機前準備：排除風險，確保儀器 “就緒"

1. 流動相檢查與制備

• 溶劑需用色譜純級（如甲醇、乙腈），水需為超純水（電阻率≥18.2 MΩ?cm），避免雜質污染色譜柱或檢測器；

• 若流動相含緩沖鹽（如磷酸鹽、醋酸鹽），需用 0.22 μm 濾膜減壓抽濾（有機相用有機相濾膜，水相用水相濾膜），防止鹽結晶堵塞管路；

• 混合流動相（如甲醇 - 水 = 7:3）需先混合再超聲脫氣（脫氣時間 5-10 分鐘），或通過儀器在線脫氣機，避免氣泡進入泵體導致壓力波動、基線噪音。

• 流動相需符合 “無雜質、無氣泡、適配色譜柱" 原則：

2. 色譜柱檢查

• 確認色譜柱型號與實驗需求匹配（如反相柱 C18、正相柱 SiO?），檢查柱芯是否松動、柱效是否正常（可通過標準品驗證）；

• 若長期未使用，需先查看柱保存液（如 C18 柱常用甲醇保存），若流動相與保存液極性差異大（如保存液為甲醇，流動相為水），需用 “過渡流動相"（如 50% 甲醇 - 水）緩慢沖洗 20-30 柱體積，避免柱床塌陷。

3. 儀器狀態檢查

• 檢查輸液泵、進樣器、柱溫箱、檢測器（如紫外檢測器）的電源、數據線是否連接正常；

• 紫外檢測器需提前預熱（通常 30 分鐘），確保燈源（氘燈 / 鎢燈）能量穩定（能量值需符合儀器要求，如氘燈能量≥800）。

二、開機與系統平衡：讓系統進入 “穩定狀態"

1. 開機順序：遵循 “先低后高、先泵后檢測器"

• 先打開計算機與色譜工作站，再依次開啟輸液泵、柱溫箱、檢測器，避免儀器電路沖擊；

• 柱溫箱需設置目標溫度（如 25℃、30℃，波動≤±0.1℃），待溫度穩定后再啟動泵（防止溫度變化導致流動相粘度波動，影響流速）。

2. 流動相流速與梯度設置

• 啟動輸液泵時，先以低流速（如 0.2-0.5 mL/min） 沖洗管路，逐步升至目標流速（如 1.0 mL/min），避免突然高壓沖擊色譜柱；

• 若用梯度洗脫，需在方法中設置 “梯度程序"（如時間 0-10min，甲醇從 5% 升至 95%），確保梯度平滑無突變。

3. 系統平衡判斷

• 平衡核心是 “基線穩定"：紫外檢測器基線漂移≤0.01 mAU/h，噪音≤0.005 mAU；

• 若流動相含緩沖鹽，需平衡 30-60 分鐘（或 20-30 柱體積），直至壓力、基線無波動，再進樣分析。

三、樣品處理與進樣：避免污染，保證重復性

1. 樣品預處理：關鍵在 “純凈度與溶解性"

• 樣品需溶解于流動相（或與流動相兼容的溶劑），避免沉淀堵塞進樣閥或色譜柱；

• 用 0.22 μm 濾膜（與樣品溶劑匹配）過濾樣品，去除懸浮雜質；若樣品濃度過高，需用流動相稀釋至線性范圍內（通過標準曲線驗證）。

2. 進樣操作：控制 “精度與一致性"

• 進樣器（如 10 μL、20 μL 定量環）需提前用樣品溶液潤洗 3-5 次，避免殘留溶劑影響樣品濃度；

• 手動進樣時，需 “快速切換閥位"（從 “Load" 到 “Inject"），且每次進樣速度、力度一致；自動進樣器需檢查樣品瓶密封性，避免溶劑揮發。

3. 進樣后觀察

• 進樣后實時監控壓力、基線：若壓力突然升高（如超過柱壓上限），需立即停泵，排查是否有堵塞；若峰形異常（如拖尾、分裂），需檢查樣品是否污染或色譜柱是否失效。

四、數據分析與記錄：確保結果 “準確可追溯"

1. 數據采集與積分

• 色譜工作站需設置合理的采集參數（如采樣頻率 10 Hz，積分閾值 0.001 mAU），避免漏峰或積分誤差；

• 手動積分時，需統一積分起點、終點（如峰高 10% 處），確保同批次樣品積分標準一致。

2. 結果驗證與記錄

• 用標準品驗證系統適用性：理論塔板數（N）≥2000（反相柱 C18），分離度（R）≥1.5，重復性（RSD）≤2%（n=5 次進樣）；

• 詳細記錄實驗信息：流動相組成、色譜柱型號、柱溫、流速、進樣量、標準品濃度、樣品編號、峰面積 / 峰高、計算結果等，確保數據可追溯。

五、關機后維護：延長儀器壽命的核心

1. 流動相清洗：重點在 “防鹽結晶"

• 若流動相含緩沖鹽（如磷酸鹽），關機前需用 “過渡流動相"（如 5% 甲醇 - 水）沖洗管路 + 色譜柱 30-40 分鐘（或 30 柱體積），再用純有機相（如甲醇、乙腈）沖洗 20-30 分鐘，避免鹽在管路或柱內結晶（結晶會堵塞管路、破壞柱床）；

• 若流動相為純有機相（無鹽），直接用純有機相沖洗 15-20 分鐘即可。

2. 儀器部件維護

• 進樣閥：用甲醇沖洗進樣口（Load 狀態下，注入 100 μL 甲醇，切換閥位沖洗），避免樣品殘留；

• 檢測器：關閉檢測器燈源（氘燈壽命約 2000 小時，非使用時及時關閉，延長壽命），若長期不用，需用甲醇擦拭流通池窗口，防止污染。

3. 環境與記錄

• 關閉儀器電源、計算機，清理實驗臺；記錄儀器使用時間、燈源壽命、色譜柱使用次數等，為后續維護提供依據。

關鍵禁忌提醒

• 嚴禁用 “腐蝕性溶劑"（如濃酸、濃堿）直接進入色譜柱（除非柱明確耐腐）；

• 嚴禁在 “無流動相" 狀態下啟動泵（會導致泵體干磨，損壞密封圈）；

• 嚴禁樣品中含 “固體顆粒或不溶物"，否則會直接堵塞色譜柱，不可逆損壞柱效。

高效液相色譜儀都在哪些領域得到廣泛應用呢？