Advanced DNA RNA 轉染試劑在 RAW264.7、THP-1 細胞中的高效應用

—— 先天免疫 lncRNA 與 miRNA 功能研究實踐

一、文獻基礎與 ZETA life 轉染試劑應用背景

本內容基于發表于免疫領域期刊《Frontiers in Immunology》的前沿研究成果展開，文獻 DOI：10.3389/fimmu.2020.581517。文章系統驗證了 ZETA life 公司 Advanced DNA RNA 轉染試劑（貨號：AD600150）在巨噬細胞先天免疫機制研究中的應用優勢。該試劑可同步完成質粒、siRNA、miRNA 模擬物 / 抑制劑的高效細胞遞送，適配 lncRNA、miRNA 介導的 ceRNA 調控通路相關全套功能驗證實驗，是單核 / 巨噬細胞非編碼 RNA 研究的理想轉染工具。

二、試劑應用體系：靶細胞、轉染底物與標準化操作方案

（一）實驗靶細胞

RAW 264.7：經典小鼠巨噬細胞系，多用于小鼠源 lncRNA 初步功能探究；

THP-1：人單核細胞細胞株，經 PMA 誘導分化為人巨噬細胞，用于人源同源非編碼 RNA 功能驗證，更貼合人體先天免疫研究場景。

（二）各類轉染核酸底物及實驗用途

過表達質粒 （1）Gm28309 過表達質粒（Gm28309 (+)）：用于上調 lncRNA Gm28309 表達，開展功能獲得型實驗； （2）pGL3 熒光素酶報告質粒：構建攜帶 Gm28309 野生型（WT）、突變型（Mut）片段，以及 kB-Ras2 mRNA 3'UTR 野生 / 突變序列的重組載體，為 ceRNA 分子相互作用驗證提供雙熒光素酶報告檢測體系。

siRNA 干擾片段 構建靶向 P3852、P33714 等 6 種候選 lncRNA 的特異性 siRNA，用于 lncRNA 敲低實驗（功能缺失驗證），全部 siRNA 序列詳見原文補充附表 Supplementary Table 1。

miRNA 功能調控試劑 （1）miR-3068-5p mimic：外源導入模擬 miRNA，提升細胞內 miR-3068-5p 水平，模擬其內源生物學功能； （2）miR-3068-5p inhibitor：特異性拮抗細胞內成熟 miR-3068-5p，阻斷其對下游靶基因的抑制作用。

（三）標準化轉染操作流程

實驗采用 ZETA life Advanced DNA RNA 轉染試劑，將轉染試劑與質粒或 siRNA 核酸按照 1:1 體積比例充分混勻，制備轉染復合物后加入細胞培養體系；轉染孵育 24 h 后收集細胞上清與細胞沉淀，開展炎癥因子檢測、蛋白免疫印跡、熒光素酶活性檢測、胞內活菌計數等分子與細胞水平檢測，完整操作細則參照原文 Materials and Methods 章節。

三、依托該轉染體系獲得的核心實驗結論

借助該高效轉染方案，本研究完整闡明 lncRNA Gm28309 在布魯氏菌感染誘導巨噬細胞炎癥應答中的調控通路，核心結論分為三大板塊：

1. lncRNA 調控 NLRP3 炎癥小體與巨噬細胞抗感染免疫

（1）敲低人源同源 lncRNA P33714 后，巨噬細胞 IL-1β、IL-18 炎癥因子分泌量顯著上升，同時可顯著抑制布魯氏菌在細胞內的存活與增殖（原文圖 3）； （2）過表達小鼠 lncRNA Gm28309 能夠顯著抑制 NLRP3 炎癥小體活化，下調 NF-κB 通路 p65 蛋白磷酸化水平，減少 IL-1β、IL-18 釋放，進而促進布魯氏菌實現胞內免疫逃逸（原文圖 4）。

2. ceRNA 分子互作機制驗證

lncRNA Gm28309 具備內源 miRNA 海綿（ceRNA）功能，可特異性吸附結合 miR-3068-5p，解除 miR-3068-5p 對靶基因 kB-Ras2 的轉錄后抑制，進而調控下游 NF-κB 炎癥信號通路，最終改變巨噬細胞抗感染炎癥反應強度；雙熒光素酶報告實驗直接證實 Gm28309 與 miR-3068-5p 存在特異性直接結合關系（原文圖 5C、5D）。

3. miR-3068-5p/NF-κB 通路功能回補驗證

抑制 miR-3068-5p 表達，或使用 NF-κB 通路特異性抑制劑 JSH-23 阻斷 p65 活化，均可明顯減弱 NLRP3 炎癥小體激活程度，提升胞內布魯氏菌存活數量。該結果反向印證 Gm28309/miR-3068-5p/kB-Ras2/NF-κB 信號軸是調控布魯氏菌感染先天免疫的核心通路（原文圖 6）。

四、研究學術價值

本研究以 ZETA life Advanced DNA RNA 轉染試劑為核心實驗工具，在 RAW264.7 小鼠巨噬細胞、PMA 誘導分化 THP-1 人巨噬細胞兩套模型中，完整完成 lncRNA-miRNA ceRNA 調控網絡的功能與機制驗證。研究揭示 lncRNA Gm28309 介導布魯氏菌免疫逃逸的分子通路，為胞內菌感染性疾病的先天免疫調控研究提供全新分子靶點與標準化細胞實驗范式，相關成果已發表于國際免疫學期刊《Frontiers in Immunology》。