一、實驗原理

二、前期準備 & 禁忌

1. 試劑

• DSG（79642-50-5）

• 無水 DMSO / 無水 DMF（溶 DSG，必須無水）

• 無胺交聯緩沖液：pH 7.4 無菌 PBS 或 20 mM 碳酸氫鈉緩沖液 pH 8.0–8.3

• 淬滅液：1 M 甘氨酸（pH 7.5–8.0）

• 蛋白樣品 / 細胞樣品

2. 嚴格禁忌

三、試劑配制

1. DSG 母液（現配）

   用無水 DMSO配成 10–20 mM 母液

   例：3.26 mg DSG 溶于 1 mL 無水 DMSO = ~10 mM

2. 淬滅工作液：1 M 甘氨酸，調 pH 至 7.5–8.0

四、方案一：純化蛋白 體外交聯（溶液蛋白）

步驟

1. 將蛋白樣品置換到無胺 PBS pH7.4，調整蛋白濃度 0.5–2 mg/mL

2. 按終濃度 0.5–2 mM 加入新鮮配制的 DSG-DMSO 母液

   （常用終濃度：1 mM 起始優化）

3. 室溫 / 4℃ 孵育 30–60 min

4. 加入 1 M 甘氨酸至終濃度 20–50 mM，室溫孵育 15 min 終止交聯

5. 后續可做：SDS-PAGE、Western blot、質譜檢測互作蛋白

五、方案二：完整細胞 內源交聯（細胞內 / 膜蛋白，DSG 強項）

步驟

1. 棄細胞培養液，預冷無胺 PBS洗細胞 2 次，去除殘留培養基（含胺會干擾）

2. 加入適量預冷無胺 PBS 覆蓋細胞

3. 加入新鮮 DSG 母液，終濃度 0.25–1 mM

4. 4℃ 避光孵育 30–45 min（溫和交聯，減少非特異）

5. 加甘氨酸至終濃度 20 mM，4℃孵育 10 min 淬滅剩余交聯劑

6. 棄上清，PBS 洗 1 次，收集細胞、裂解，后續 WB/Co-IP/ 質譜

六、關鍵參數優化（直接照著調）

1. DSG 終濃度

• 純蛋白：0.5～2 mM

• 活細胞：0.25～1 mM（濃度太高非特異交聯多）

2. 反應 pH： pH 8.0–8.3，反應最快；pH7.4 溫和特異

3. 反應時間：30 min 基礎，最長不超 60 min

4. 溫度：4℃特異度高；室溫反應快、背景略高

七、注意事項

1. DSG 極易水解，母液配好 1 分鐘內必須加樣

   2 DMSO 終濃度控制在 ≤5%，避免蛋白變性、細胞毒性

   3 交聯后樣品建議立即處理或 - 80℃分裝凍存

   4 如需可逆交聯，換用 DSP；不可逆穩定交聯用本 DSG 即可