DSP CAS：57757-57-0

全稱：二琥珀酰亞胺基 3,3'- 二硫代二丙酸酯

特點：含二硫鍵、NHS 酯胺反應、細胞膜可透、還原可逆

加 DTT/β- 巰基乙醇 即可打斷交聯鍵，變回蛋白單體，適合 Co-IP、蛋白互作驗證、質譜。

一、實驗原理

• 非還原條件：保持蛋白交聯復合物

• 加還原劑（DTT/β-ME）：二硫鍵斷裂 → 交聯解離，可逆

二、試劑與禁忌

所需試劑

1. DSP 交聯劑

2. 無水 DMSO（配母液，必須無水）

3. 無胺交聯緩沖液：pH7.4 無菌 PBS（禁用 Tris、甘氨酸、咪唑、HEPES 外胺類）

4. 淬滅液：1 M 甘氨酸 pH 7.5–8.0

5. 還原劑：1 M DTT 或 β- 巰基乙醇

6. 蛋白樣品 / 貼壁 / 懸浮細胞

核心禁忌

• 緩沖液絕對不能含伯胺，會直接消耗 DSP

• DSP 遇水極速水解，母液現配現用，不可保存

• DMSO 終濃度控制 ≤5%，防止蛋白變性、細胞毒性

三、試劑配制

1. DSP 10 mM 母液（現配）

   DSP 分子量：368.35

   稱取 3.68 mg DSP，溶于 1 mL 無水 DMSO，即為 10 mM 母液。

2. 淬滅液：1 M 甘氨酸調 pH 7.5–8.0

3. 還原工作液：SDS 上樣緩沖液加入 50–100 mM DTT

四、方案 1：純化蛋白 體外交聯（可逆）

1. 蛋白置換到無胺 PBS pH7.4，濃度調至 0.5–2 mg/mL

2. 加入新鮮 10 mM DSP 母液，終濃度 0.25～1 mM（推薦起始 0.5 mM）

3. 4℃ 孵育 30–45 min

4. 加 1 M 甘氨酸至終濃度 20 mM，室溫 15 min 淬滅終止

5. 樣品分兩管：

• 管 A：不加還原劑（非還原，保留交聯條帶）

• 管 B：加 DTT 至終濃度 50 mM，95℃煮 5 min（斷裂二硫鍵，解交聯）

6. 直接上 SDS-PAGE/WB，對比可逆前后條帶

五、方案 2：完整細胞 內源交聯（細胞 / 膜蛋白）

1. 棄培養基，預冷無胺 PBS洗細胞 2 次，洗掉含胺培養基

2. 加少量預冷無胺 PBS 覆蓋細胞

3. 加新鮮 DSP 母液，終濃度 0.125～0.5 mM

4. 4℃避光孵育 30–40 min

5. 加 1 M 甘氨酸至終 20 mM，4℃靜置 10 min 淬滅

6. 棄液，PBS 洗 1 次，收集細胞、裂解制樣

7. 樣品同樣分還原 / 非還原兩組煮樣電泳

六、關鍵可逆操作（必做）

1. 非還原組：上樣緩沖液不加 DTT → 看到高分子交聯復合物條帶

2. 還原組：加 DTT/β-ME 煮沸 → 交聯解開，只出現蛋白單體條帶

   以此證明是DSP 特異性可逆交聯

七、參數優化參考

1. DSP 干粉 -20℃密封干燥保存，避免受潮水解

2. 母液配完立刻加樣，放置超過 3 分鐘活性大幅下降

3. 若做 Co-IP：交聯→淬滅→裂解→IP，最后洗脫后再加 DTT 解交聯，檢測互作蛋白

4. 和 DSG 區別：DSG不可逆；DSP還原劑可裂解，做互作驗證選 DSP