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             頭孢克肟快速檢測試劑盒使用說明書

【測定原理】

        本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物頭孢克肟將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗頭孢克肟抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物頭孢克肟的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物頭孢克肟的含量。

【試劑盒技術指標】   

規      格：96孔/盒

靈 敏 度： 1ppb

檢測時間： 75min

樣本檢測下限：

組織 ………………………………………4ppb

牛奶 ………………………………………40ppb

交叉反應率：

頭孢克肟…………………………100%

樣本回收率：

組織 …………………………………85%±10%

牛奶 …………………………………95%±15%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、 酶標記物 12ml…………………………紅色帽

4、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

5、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

7、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

8、 20X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

9、 2X 濃縮復溶液  50ml ·………………   藍色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、

                       刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮

                       吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20μl～200μl、單道100μl～

                        1000μl、多道 30～300 μl

試           劑：濃磷酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、正己烷

【樣本前處理步驟】

u 樣本處理前須知

（1）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試

劑時要更換吸頭。

（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，

必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實

驗結果。

u 樣本前處理需配制：

配液1、將濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋（1份濃縮復溶液+1份去離子水）。

配液2、0.05 M 鹽酸溶液

量取 2.1ml 濃鹽酸加入去離子水中定容至500ml，混勻。

配液3、提取工作液

量取 80ml 乙腈加入 20ml 0.05M 鹽酸中，混勻。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

u 樣本處理：

（a）牛奶樣本的處理方法

1、 取牛奶1ml，按1:39稀釋，混合30s。（50 ul牛奶+1950 ul稀釋后的復溶液）

2、 取50ul用于分析。

稀釋倍數：40

（b）雞肉、雞肝樣本的處理方法

1、 稱取 2.0±0.05g 均質后的組織樣本至 50ml 聚苯乙烯離

心管中，加入 8ml 提取工作液，用振蕩器振蕩 5min，3000g 離心 5min；室溫4000r/min以上，離心10min；

2、 移取 1ml 上清至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中， 50-60℃于

水浴氮氣流下吹干；

3、 加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動 30s 溶解干燥殘留物，再加入 1ml 稀釋后的復溶液，用渦旋儀渦動 30s，3000g 離心5min；去上層液體取50ul下層液， 

4、 取50ul用于分析。

樣本稀釋倍數：4

【酶標免疫分析程序】

 測定前應須知：

1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試

      劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品/樣本50µl /孔，然后入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應30min。

6、 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 顯色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

9、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含頭孢克肟的含量成負相關。

1、粗略判定：

      用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243；1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中頭孢克肟實際濃度。        

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以頭孢克肟標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中頭孢克肟實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

 

         1          3          9          27         81

頭孢克肟(ppb) [µg/kg]

圖1：頭孢克肟檢測試劑盒的回歸曲線

 

4、再現性：

 

%CV 

 

   0      1       3        9       27      81

頭孢克肟(ppb) [µg/kg]

圖2：頭孢克肟檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出頭孢克肟檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應頭孢克肟濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。