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           頭孢拉定快速檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

【測(cè)定原理】

       本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物頭孢拉定將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗頭孢拉定抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物頭孢拉定的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物頭孢拉定的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 1ppb

檢測(cè)時(shí)間： 75min

樣本檢測(cè)下限：

組織 ………………………………………4ppb

牛奶 ………………………………………40ppb

反應(yīng)率：

頭孢拉定……………………………………100%

樣本回收率：

組織 …………………………………85%±10%

牛奶 …………………………………95%±15%

【試劑盒組成】

1、 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品X1瓶 1ppm

4、 酶標(biāo)記物 12ml…………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

8、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

10、 2X 濃縮復(fù)溶液  50ml ·………………  藍(lán)色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、

                      刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮

                      吹儀、刻度移液管

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20μl～200μl、單道100μl～

                       1000μl、多道 30～300 μl

試           劑：濃磷酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、正己烷

【樣本前處理步驟】

u 樣本處理前須知

（1）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試

劑時(shí)要更換吸頭。

（2）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，

必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)

驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1、將濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）。

配液2、0.05 M 鹽酸溶液

量取 2.1ml 濃鹽酸加入去離子水中定容至500ml，混勻。

配液3、提取工作液

量取 80ml 乙腈加入 20ml 0.05M 鹽酸中，混勻。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

u 樣本處理：

（a）牛奶樣本的處理方法

1、 取牛奶1ml，按1:39稀釋，混合30s。（50 ul牛奶+1950 ul稀釋后的復(fù)溶液）

2、 取50ul用于分析。

稀釋倍數(shù)：40

（b）雞肉、雞肝樣本的處理方法

1、 稱取 2.0±0.05g 均質(zhì)后的組織樣本至 50ml 聚苯乙烯離

心管中，加入 8ml 提取工作液，用振蕩器振蕩 5min，3000g 離心 5min；室溫4000r/min以上，離心10min；

2、 移取 1ml 上清至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中， 50-60℃于

水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

3、 加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動(dòng) 30s 溶解干燥殘留物，再加入 1ml 稀釋后的復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng) 30s，3000g 離心5min；去上層液體取50ul下層液，

4、 取50ul用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4

【酶標(biāo)免疫分析程序】

測(cè)定前應(yīng)須知：

1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試

     劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 顯色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

9、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含頭孢拉定的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

     用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243；1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中頭孢拉定實(shí)際濃度。        

1、定量分析：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以頭孢拉定標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中頭孢拉定實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

        1         3          9          27         81

頭孢拉定(ppb) [µg/kg]

圖1：頭孢拉定檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

  0      1       3        9       27      81

頭孢拉定(ppb) [µg/kg]

圖2：頭孢拉定檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出頭孢拉定檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)頭孢拉定濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號(hào)見(jiàn)外包裝。