無細胞膜蛋白表達與合成系統(tǒng)（eProtein Discovery）

英國Nuclera公司的eProtein Discovery是一個無細胞蛋白質合成（CFPS）系統(tǒng)，也被稱作體外轉錄/翻譯系統(tǒng)，能夠實現(xiàn)蛋白質的快速原型設計。該系統(tǒng)采用數字微流控卡盒和定制試劑，可同時自動篩選多達88種膜蛋白表達條件，包括在8種無細胞表達條件下對最多11種膜蛋白的篩選。在48小時內完成從DNA到膜蛋白的篩選與放大生產。

使用eProtein Discovery系統(tǒng)快速無細胞表達和純化活性膜蛋白MsbA并驗證其功能和結構

一、引言

膜蛋白對細胞功能十分重要，超過60%的FDA批準藥物以膜蛋白為靶點，因此藥物研發(fā)需要快速生產膜蛋白。傳統(tǒng)的膜蛋白生產方法依靠去垢劑提取細胞膜，這往往會使蛋白質不穩(wěn)定，導致蛋白質解折疊、聚集、非天然構象或失去活性。為滿足下游應用需求而去除去垢劑的過程進一步增加了純化難度，給結構和功能研究帶來挑戰(zhàn)。

eProtein Discovery系統(tǒng)通過整合無細胞蛋白質合成（CFPS）與自動化數字微流控篩選，與傳統(tǒng)系統(tǒng)不同，無細胞蛋白質合成無需基于去垢劑的膜提取，可以直接優(yōu)化納米盤——納米盤是一種脂質雙層模擬物，由磷脂分子和膜支架蛋白組成，能為膜蛋白提供接近天然生物膜的脂質環(huán)境，從而維持其結構穩(wěn)定和生物活性。可在24小時內完成11種DNA構建體和8組表達條件（無細胞混合體系）的篩選。這使得僅用48小時就能生產出正確折疊、有活性且適用于冷凍電鏡分析的膜蛋白。

圖1：eProtein Discovery系統(tǒng)膜蛋白生產工作流程

本文展示了eProtein Discovery技術如何實現(xiàn)MsbA的高產。MsbA是一種原核生物ABC轉運蛋白，對革蘭氏陰性菌中脂質A的轉運及外膜完整性十分重要。它是膜結合的同源二聚體結構，具有六個跨膜螺旋，這導致其產量低、易錯誤折疊和聚集現(xiàn)象。通過優(yōu)化納米盤的組成，該技術在48小時內生產出具有功能的MsbA，并經ATP酶活性測定和冷凍電鏡結構分析驗證。

二、數據

1、MsbA納米盤篩選產量高于去垢劑法

通過eProtein Discovery技術對不同組成的納米盤進行篩選后發(fā)現(xiàn)，與去垢劑Brij-35相比，MsbA的產量明顯提高，這凸顯了類天然脂質雙層環(huán)境對膜蛋白穩(wěn)定性的優(yōu)勢（圖2）。在8組表達條件中，含MSP1D1 dH5-DMPG的納米盤純化產量更高，與單獨使用緩沖液相比，產量提升了5倍。

圖2：利用納米盤和去垢劑進行MsbA的表達與純化。8組表達條件下MsbA產量對比

2、MsbA放大與濃縮

在確定MSP1D1 dH5-DMPG為更好納米盤組成后，成功對 MsbA 進行了放大培養(yǎng)，獲得了 120 μg/mL 的純化蛋白（圖 3A）。該產量與基于熒光的卡盒式產量預測結果高度吻合。此外，MsbA 被濃縮 15 倍至 1.8 mg/mL，且無明顯聚集或沉淀現(xiàn)象。SDS-PAGE 結果證實了 MsbA 樣品的純度。

圖3：MsbA的放大培養(yǎng)與濃縮。(A) 優(yōu)化納米盤條件下純化的MsbA產量，與卡盒預測產量（藍色）的對比。(B) 未濃縮MsbA的SDS-PAGE分析。

3、MsbA活性檢測

采用磷酸鹽釋放測定法對其ATP酶活性進行了評估（圖4）。結果證實，MsbA表現(xiàn)出預期的ATP酶活性，添加其底物脂質A后活性受到刺激。而ATP酶抑制劑原釩酸鹽的存在明顯降低了其活性，這進一步驗證了純化的MsbA蛋白的功能完整性。

圖4：純化MsbA的ATP酶活性。(A) 脂質A可刺激其活性，而釩酸鹽則會抑制其活性。 (B) 3600秒時的ATP水解速率。

4、MsbA冷凍電鏡分析

冷凍電鏡分析純化的MsbA-納米盤復合物證實其結構與ABC轉運蛋白一致，MsbA在納米盤環(huán)境中呈現(xiàn)正確折疊的構象。與已發(fā)表的冷凍電鏡重建結構的比對結果進一步證實，eProtein Discovery技術不僅能快速生產MsbA，還能保留其天然的結構動態(tài)特性。此外，多聚體組裝分析顯示，MsbA正確組裝為二聚體構象——這是ABC轉運蛋白發(fā)揮功能的關鍵前提。

圖5：納米盤中MsbA的冷凍電鏡分析。(A) 純化的MsbA在納米盤中的冷凍電鏡顯微圖顯示出輪廓清晰的顆粒。(B) 二維分類圖像，呈現(xiàn)MsbA的清晰特征。(C) 從頭重建的三維模型，證實其正確折疊和二聚化狀態(tài)。

三、結論

eProtein Discovery系統(tǒng)成功實現(xiàn)了在48小時內快速、高產生產出具有功能且結構完整的MsbA。與傳統(tǒng)表達系統(tǒng)不同，這種無細胞方法無需依賴去垢劑提取膜成分，減少了蛋白質的不穩(wěn)定性，同時保留了其天然折疊狀態(tài)和活性。通過利用基于納米盤的穩(wěn)定化技術，該系統(tǒng)快速優(yōu)化了表達條件，最終獲得了折疊正確、適用于冷凍電鏡分析的ABC轉運蛋白。這些表明eProtein Discovery系統(tǒng)是一套具有變革意義的系統(tǒng)，能夠加速膜蛋白的生產，對以難研究的膜蛋白為靶點的藥物研發(fā)具有深遠意義。

英國Nuclera公司由劍橋大學的博士生們于2013年創(chuàng)立。在撰寫論文期間，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質難以獲取的問題是生物學領域的首要障礙和關鍵瓶頸。他們著手解決蛋白質難以獲取的問題，以期改善人類健康狀況。公司的愿景是打造出從DNA到蛋白質的原型設計系統(tǒng)，以減少在藥物發(fā)現(xiàn)計劃中獲得靶蛋白的時間和障礙。

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