人血小板裂解液hPL替代FBS的細胞培養解決方案

細胞治療因其具體獨特的靶向作用和長期療效，成為新藥研發的熱點。隨著細胞療法逐漸步入臨床試驗，細胞培養尤為重要，從而對細胞培養基補充劑的需求也越來越大。胎牛血清（FBS）一直以來被作為是細胞培養的常用補充劑，遺憾的是涉及倫理和安全問題。如今，從加工過的血液中提取的人源培養基補充劑已經得到越來越多的使用。人血小板裂解液（hPL）是可用于臨床和商業化制備細胞治療產品的補充劑之一。hPL來源于混合人的血小板，經連續反復多次的凍融裂解獲得，其含有的生長因子和細胞因子與胎牛血清（FBS）和人AB血清相同且含量相當。

另一方面，細胞治療的人原代細胞體外培養及擴增并非易事，國家食品藥品監督管理總局組織制定的《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》中有明確指出：“細胞培養過程中，應盡量避免使用動物來源的物質，比如應盡量避免血清的使用，若必須使用血清，需要提供相關的研究資料說明使用的必要性和合理性；嚴禁使用疫病流行區來源的動物血清；不得使用未經過安全性驗證的血清"。

因此，探索更加安全、成分更加明確的血清替代物對于細胞治療產品的穩定持續生產至關重要。

01 E-beam原理和傳統γ-輻照技術

一般而言，血小板（hPL的制作原材料）相關的篩查和測試標準是與輸血前血液篩查相同。我們知道，傳染性病原體（特別是人類傳染病病毒）的傳播是人類血小板衍生產品（如hPL）的一個考慮因素，且多個供體的混合血小板裂解液雖可提高hPL批間一致性和性能，但同時增加了病毒污染的風險。

通常，醫療和食品通過電子束（E-beam）或γ射線輻照滅殺病毒。有研究表明，通過γ照射hPL能有效地滅活病毒，但會造成hPL的部分生長因子喪失、不良的產物特性（如渾濁現象），以及細胞擴增效能降低的影響。因此，通常還需通過添加蛋白質穩定劑等額外的步驟來減輕不良影響，但又可能會引入新的風險問題。

圖1 Sexton品牌病原體減少PR工藝設計流程

與傳統的γ輻射方式不同，美國Sexton公司生產了一種pathogen-reduced病原體減少的hPL (PR hPL)，采用電子束照射（E-beam）的過程來降低病毒傳播的風險。E-beam原理：通過電子束直接作用，電子束激發水分子產生羥基自由基、還原性水合電子等活性粒子的氧化-還原的間接作用，對包括病毒等微生物體內的DNA或RNA分子以及蛋白質包膜產生破壞，進而達到病毒減少工藝的作用效果。

美國Sexton PR系列產品，依照國際人用藥品注冊技術協調會ICH/295/95和世衛組織WHO相關附件被用作設計病毒清除驗證的指南，建立待驗證工藝的縮小模型，將工廠生產的nLiven PR，運送到測試實驗室，在待驗證樣品中人為地加入一定種類和數量的病毒（針對血漿來源常規的代表性模型病毒）。然后產品進行病毒去除/滅活工藝步驟，處理，并返回到測試實驗室進行病毒減少驗證分析。

圖2 Sexton品牌病原體減少PR工藝設計流程

通過對經PR工藝處理的Sexton PR系列hPL產品進行生長因子水平和病毒測試（流程見圖2：左圖是E-beam處理hPL后的生長因子分析和細胞擴增實驗，右圖是E-beam處理hPL后的病毒分析），可證明PR工藝可以實現在不顯著影響hPL組成和hPL功能的情況下，實現病原體減少，發揮良好的細胞培養補充物性能。

02 PR工藝hPL性能驗證與實驗結果

1. 細胞因子水平驗證

針對以下的常見hPL中的細胞因子，使用ELISA法對普通hPL（藍色）和電子束輻照的nLiven PR（紅色），分別進行3組重復分析求取平均值，用以評價PR工藝對hPL產品細胞因子含量的影響。

圖3 PR工藝的hPL中FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比較

實驗發現：除了3A圖中的FGF水平，其他細胞因子（如3B圖中的EGF、3C圖中的PDGF-AB、3D圖中的TGF-β以及3E圖中的PDGF-BB）在通過電子束照射（E-beam）的PR工藝獲得的hPL中的含量與普通hPL對比是相對偏高的。

2. 細胞擴增生長驗證

實驗人員以BM-MSCs培養實驗為例來驗證PR工藝hPL的產品性能。

圖4 PR工藝的hPL與其他補充劑的細胞擴增數目與形態比較

將BM-MSCs以2X10*4個細胞/孔的密度接種在12孔板中，培養4~5天，收獲后計數。比較在含有hPL、PR hPL和γ-輻照FBS的培養基中培養的BM-MSCs的細胞增殖率。

BM-MSCs相對細胞擴增數結果比較：Sexton品牌的Stemulate產品和PR工藝的nLiven PR產品相對于γ-輻照的FBS組獲得更多的細胞擴增數目。BM-MSCs細胞形態比較：Sexton品牌的兩款hPL相對于γ-輻照的FBS細胞生長更為致密和均一。

3. 病原體減少工藝的驗證

使用牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）進行標準病毒空斑試驗，用以評估生產工藝去除/滅活病毒的能力，進行相關病原體減少/去除效果的驗證。主要在應用電子束處理病原體步驟之前，將BVDV刺突病毒引入樣品，然后對經電子束處理過的樣本進行殘留病毒分析。如下圖表中所示PR工藝的hPL的顯示模型包膜病毒BVDV減少了6個對數值。

圖表 病原體減少結果

4. 其他PR工藝的hPL生化指標

圖5  PR工藝的hPL關于滲透壓、pH以及總蛋白的批間一致性數據展示

結果顯示：美國Sexton品牌的nLiven PR血小板裂解液使用E-Beam進行病原體處理的產品關于滲透壓、pH以及總蛋白的32個批次的一致性數據展示，可見CV值小于10%，展現了nLiven PR產品良好的批次間一致性。

03 文末結論

通過實驗驗證，在Stemulate或nLiven PR中生長的BM-MSCs始終顯示出強勁的細胞擴增，nLiven PR尤為明顯。在其他干細胞擴增實驗中，結果也如此。

圖6 Sexton品牌的nLiven PR、Stemulate以及T-Liven PR產品

Sexton Biotechnologies的nLiven PR是一種經過驗證的、*的病原體減少工藝處理的產品，為細胞培養提供一致的、高質量的培養基添加物。與nLiven PR不同的是，Sexton公司的T-Liven PR是PR處理的血小板裂解液的封閉袋裝系統版本，包括T細胞生長驗證試驗的放行測試，確保免疫細胞培養過程中的細胞質量。

有趣的是，T-Liven PR在被應用于T細胞等免疫細胞相關治療時，對于CAR轉導T細胞的表型也被發現具有顯著的優勢。(Torres-Chavez等人2019年，請聯系曼博生物獲取相關文獻資料)

本文基于Sexton Biotechnologies公開資料，由其中國提供方上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。曼博生物長期提供PR工藝hPL血小板裂解液、細胞培養補充劑等產品，支持細胞治療與干細胞培養相關應用。如想咨詢具體產品，可掃描下方圖片聯系曼博生物。