用于研究基于寡核苷酸療法的遞送與療效的肝臟微生理系統

（注：本文原英文資料可聯系上海曼博生物獲取）

本文核心信息

• 寡核苷酸療法具有高度的人類特異性，需要更為以人為中心的開發方法。
  

• 微生理系統（MPS）以更具生理相關性的方式復制細胞和組織的結構和功能性生物標志物。
  

• 我們的研究證明了肝臟MPS和寡核苷酸遞送測定在檢測靶向肝臟的寡核苷酸的攝取和基因敲低方面的有效性。
  

• MPS的洞察有助于推動那些動物模型適用性較差的新型模式藥物的開發，從而使初次人體研究的信息更充分。

一、引言：寡核苷酸療法臨床前測試的核心痛點

隨著新藥物模式進入臨床試驗，對與人體相關的體外模型的需求日益增加。傳統的臨床前動物模型通常無法準確預測藥物的療效和毒性，導致后期藥物損耗率居高不下。諸如寡核苷酸療法等新藥物模式具有高度的人體特異性，需要以人體為核心的開發方法。非人物種通常不適合進行測試，而更相關的選擇，如非人靈長類動物，不僅成本高昂，而且在倫理上存在挑戰。因此，與人體相關的新方法方法學，例如器官芯片技術，對于提高臨床前測試的預測能力很重要。器官芯片，也稱為微生理系統，通過在灌注式3D支架上培養原代人體細胞，以更具生理相關性的方式復制細胞和組織的功能性生物標志物(Rubianoetal.,2021)。在初次人體試驗之前，MPS有潛力為評估和設計寡核苷酸療法提供一種更具生理學意義的途徑。

基于寡核苷酸的療法，即基于RNA的療法，是干擾特定RNA分子的短序列，包括反義寡核苷酸、RNA干擾、小干擾RNA、微小RNA和適配體(Robertsetal.,2020)。對這些療法的興趣源于對人類基因組的理解，以及相較于傳統小分子化合物，它們更快的藥物發現過程。更近的進展，如脂質納米顆粒和GalNAc偶聯技術，實現了向肝臟的靶向藥物遞送。GalNAc通過肝細胞上的去唾液酸糖蛋白受體靶向肝臟。GalNAc偶聯的寡核苷酸與ASGPR結合，被內吞，并釋放治療性寡核苷酸以靶向特定的mRNA序列(Debackeretal.,2020)。該方法增強了效力，減少了脫靶效應，并允許更長的給藥間隔和更低的免疫原性。因此，基于GalNAc的療法在治療遺傳、代謝和感染性疾病方面具有巨大潛力。

由于寡核苷酸通過GalNAc相關的內吞作用被肝細胞快速攝取，該策略已被用于設計靶向肝臟疾病的療法。它在治療傳統藥物失敗的"不可成藥"疾病方面顯示出前景。因此，我們選擇在PhysioMimix肝臟MPS和寡核苷酸遞送測定中，使用GalNAc偶聯策略靶向原代人肝細胞，研究小干擾RNA和反義寡核苷酸。曼博生物中國供應CNBio的PhysioMimix微流控芯片系統，可掃描下方查看曼博生物提供的PhysioMimix微流控芯片系統詳細信息。

二、研究目的：建立肝臟MPS寡核苷酸遞送評價體系

我們介紹CNBioPhysioMimix肝臟MPS，用于研究寡核苷酸向肝臟的遞送及其被原代人肝細胞的攝取。該肝臟MPS能生成功能穩定、狀態良好的原代人肝細胞微組織，從而能夠在14天內進行基因敲低和給藥策略的研究。

為滿足對此類療法進行適當體外測試日益增長的需求，我們在寡核苷酸遞送測定中，使用帶有和不帶GalNAc偶聯的熒光標記小干擾RNA或反義寡核苷酸靶向原代人肝細胞。我們的結果顯示，原代人肝細胞能有效攝取，并隨后敲低目標基因。

三、實驗材料與方法：肝臟MPS寡核苷酸遞送與基因敲低評價體系

每項實驗均使用PhysioMimixCore系統和定制的多芯片肝臟-12板進行。該板含有12個孔，每個孔內有獨立的膠原蛋白涂層支架，原代人肝細胞以每支架0.6×10?個細胞的密度接種（圖1A-B）。支架內的孔隙與灌注系統相結合，使細胞培養基能夠流過所形成的肝臟微組織（圖1C）。

使用靶向GAPDH基因的熒光標記GalNAc-小干擾RNA處理原代人肝細胞。這些包括：GalNAc-siGAPDH-Cy5；Naked-siGAPDH-Cy5；或GalNAc-siScrambled-FAM。除GalNAc-小干擾RNA外，我們還研究了靶向白蛋白基因的GalNAc-反義寡核苷酸。使用了以下反義寡核苷酸：GalNAc-ALBASO-Cy5；Naked-ALBASO-Cy5；或GalNAc-非靶向亂序反義寡核苷酸-FAM。使用共聚焦顯微鏡對支架進行Cy5或FAM標記成像；并分離RNA，使用qPCR技術測試GAPDH基因的敲低情況。我們研究了不同濃度（10nM-100nM）反義寡核苷酸的攝取和基因敲低效應，以及在基于肝臟MPS的寡核苷酸遞送測定中，單次給藥與重復給藥的效應比較。

每2-3天進行一次培養基更換，并使用培養基樣品評估細胞健康狀況和損傷情況。通過分別使用顯色法測定乳酸脫氫酶和酶聯免疫吸附測定法定量白蛋白的產生，評估肝細胞的健康狀況和功能性。通過免疫細胞化學評估攝取，實驗結束時，使用一半支架，經4%多聚甲醛固定后，進行白蛋白以及Hoechst33342染色。使用ZymoResearch的RNAShield和Quick-RNAMicroprep試劑盒從剩余的一半支架中提取RNA。使用Invitrogen的高容量RNA-to-cDNA試劑盒，隨后使用TaqManFast Advanced MasterMix和TaqMan基因表達測定進行qPCR，評估目標基因表達。目標基因表達以定量循環值表示，并使用內參基因Cq值進行歸一化，顯示為ΔΔCq表達，先歸一化至培養基對照(Livakand Schmittgen, 2001)。

四、實驗結果：PhysioMimix系統下寡核苷酸攝取與療效評估

結果一：使用PhysioMimixCore微生理系統生成3D人肝臟微組織

我們使用帶和不帶GalNAc偶聯的標記小干擾RNA和反義寡核苷酸，探索在基于PhysioMimix肝臟MPS的寡核苷酸遞送測定中使用這些新藥物模式。原代人肝細胞在第0天接種到各孔中，每2-3天更換培養基并取樣，寡核苷酸在第4天添加一次，或在第4、6、8天添加三次，或用培養基對照處理（圖1D）。在膠原蛋白涂層支架上可生成穩定且有功能的原代人肝細胞，用于評估標記寡核苷酸的攝取情況（圖1E）。

圖1.使用PhysioMimix核心微生理系統生成3D人肝臟微組織。(A)PhysioMimix概覽，包括控制器、擴展塢和三個帶有多芯片肝臟-12板的驅動器。(B)多芯片肝臟-12板示意圖，顯示一個開放式細胞培養孔的橫截面，其中包含用于肝細胞生長的3D支架。(C)微泵驅動細胞培養基循環，促進營養物質和氣體交換。每板可培養多達12個肝臟微組織。(D)在14天內對肝臟MPS進行寡核苷酸給藥的時間線。(E)通過明場顯微鏡成像的支架上的3D人肝臟微組織。比例尺：200μm。

結果二：在肝臟MPS中引入GalNAc偶聯、熒光標記的小干擾RNA

細胞損傷（乳酸脫氫酶）和細胞健康（白蛋白）的讀數顯示，所使用的小干擾RNA之間沒有差異。所有實驗中，乳酸脫氫酶水平通常起始于1.5-2.0RAU/10?個細胞左右，保持一致。該原代人肝細胞供體的白蛋白產量維持在20-40μg/天/10?個細胞之間，峰值產量通常出現在第6天（圖2A）。使用GalNAc偶聯的靶向小干擾RNA處理原代人肝細胞，觀察到更大的目標基因（GAPDH）敲低效果（GalNAc-siGAPDH，圖2B）。實驗結束時，肝臟微組織仍保持功能性，通過陽性白蛋白染色顯示，該染色同時也用于共標記原代人肝細胞（圖2C）。

如圖2C所示，確認了原代人肝細胞在支架孔隙中攝取了Cy5標記的小干擾RNA。盡管與GalNAc-siGAPDH圖像相比，Nkd-siGAPDH圖像中的信號強度更高（品紅色，圖2C），表明該模式攝取更多，但GalNAc偶聯模式在基因表達水平上效果更大（圖2B）。這種差異可能是由于小干擾RNA的攝取/內吞或加工方式不同所致。

圖2.在肝臟MPS中引入GalNAc偶聯、熒光標記的小干擾RNA。原代人肝細胞用濃度為0nM和100nM的小干擾RNA處理三次（第4、6、8天）。(A)在為期11天的實驗中，觀察到低乳酸脫氫酶和穩定的白蛋白產量，表明細胞健康。(B)與非偶聯的小干擾RNA相比，GalNAc偶聯的siGAPDH對目標（GAPDH）基因表達的敲低效果更大。(C)固定后的免疫熒光成像顯示Cy5標記小干擾RNA的攝取（品紅色）；細胞核（藍色）和白蛋白（黃色）。比例尺：50μm。

結果三：GalNAc偶聯靶向小干擾RNA對GAPDH的劑量依賴性敲低

接下來，我們研究了GalNAc偶聯的靶向小干擾RNA對GAPDH的敲低是否存在劑量依賴性。在原代人肝細胞第4、6、8天用濃度為10、50或100nM的小干擾RNA處理三次。如低乳酸脫氫酶水平和穩定的白蛋白產量所示，在為期11天的實驗過程中，對細胞健康無不良影響（圖3A）。我們觀察到GalNAc-siGAPDH對GAPDH基因表達的敲低呈劑量依賴性，而在Nkd-siGAPDH條件下未觀察到濃度效應（圖3B）。同時觀察到隨著濃度增加，小干擾RNA的攝取增加（品紅色，圖3C）。

圖3.GalNAc偶聯靶向小干擾RNA對GAPDH的劑量依賴性敲低。原代人肝細胞用濃度為0、10、50和100nM的小干擾RNA處理三次（第4、6、8天）。(A)在為期11天的實驗中，觀察到低乳酸脫氫酶和穩定的白蛋白產量，表明細胞健康。(B)GalNAc-siGAPDH對目標（GAPDH）基因表達的敲低呈劑量依賴性；在Nkd-siGAPDH條件下未觀察到增加濃度的效應。(C)固定后的免疫熒光成像顯示Cy5標記小干擾RNA的攝取（品紅色）；細胞核（藍色）和白蛋白（黃色）。比例尺：100μm。

結果四：單次給藥下反義寡核苷酸的持續攝取和有效基因靶向

使用靶向白蛋白基因表達的反義寡核苷酸，我們先在14天周期內，于第4天對原代人肝細胞進行了一次處理。比較第14天標記反義寡核苷酸的攝取，與GalNAc-ALBASO相比，Nkd-ALBASO的信號更強（圖4A）。盡管如此，我們觀察到在GalNAc-ALBASO條件下對ALB基因表達的敲低更多（圖4B），這與在GalNAc-小干擾RNA中觀察到的結果一致（圖2）。進一步的研究可以調查偶聯與非偶聯寡核苷酸在原代人肝細胞中的亞細胞定位，以更好地理解這些觀察到的差異。

圖4.單次給藥下反義寡核苷酸的持續攝取和有效基因靶向。(A)固定后的免疫熒光成像顯示Cy5標記反義寡核苷酸（品紅色）、細胞核（藍色）、白蛋白（黃色）和FAM標記非靶向反義寡核苷酸（綠色）的攝取。(B)在單次給予50nM濃度后，與其他條件相比，GalNAc-ALBASO對ALB基因的敲低效果更大。比例尺：100μm。

結果五：在肝臟MPS中比較GalNAc偶聯、熒光標記反義寡核苷酸的單次和重復給藥

接下來，我們旨在研究在14天周期內，單次給藥（第4天）或重復給藥（第4、6和8天）這兩種給藥策略的效果。我們發現不同治療方案間的乳酸脫氫酶和白蛋白結果相當；在比較所使用的三種不同反義寡核苷酸時，結果也相似（圖5A-B）。無論在單次給藥還是重復給藥中，與Nkd-ALBASO相比，GalNAc-ALBASO對ALB基因表達的敲低均更大（圖3C-D）。與重復給藥導致更大基因敲低的結果一致，我們觀察到，與單次給藥相比，重復給藥中靶向白蛋白基因和亂序對照的反義寡核苷酸的攝取均更多（圖5E-F）。這凸顯了肝臟MPS能夠促進重復給藥的能力，而這在新藥物模式的臨床應用中通常是常態。

圖5.在肝臟MPS中比較GalNAc偶聯、熒光標記反義寡核苷酸的單次和重復給藥。原代人肝細胞在14天周期內，用靶向白蛋白基因表達的反義寡核苷酸處理一次（單次；第4天）或三次（重復；第4、6、8天）。在（A）單次和（B）重復給藥條件下，為期14天的實驗中，低乳酸脫氫酶和穩定的白蛋白水平表明細胞健康。在（C）單次和（D）重復給藥條件下，GalNAc偶聯靶向ALB的反義寡核苷酸、非偶聯靶向ALB的反義寡核苷酸以及GalNAc偶聯非靶向反義寡核苷酸的基因表達情況。免疫熒光成像顯示在（E）單次和（F）重復給藥條件下的細胞核（藍色）、白蛋白（黃色）、Cy5標記靶向反義寡核苷酸（品紅色）和FAM標記非靶向反義寡核苷酸（綠色）。比例尺：100μm。

四、討論分析：肝臟MPS在寡核苷酸攝取與基因敲低中的應用價值

在這項研究中，我們展示了肝臟MPS在檢測靶向肝臟的寡核苷酸的攝取和基因敲低方面的有效性。我們使用了靶向GAPDH基因的小干擾RNA和靶向ALB基因的反義寡核苷酸。對于每種模式，我們都包含了一個非編碼亂序對照，以評估無基因靶向時的細胞攝取。我們的結果顯示，單次給藥時，我們的系統能有效攝取小干擾RNA和反義寡核苷酸，且重復給藥時攝取增加。與非偶聯模式相比，GalNAc偶聯的小干擾RNA和反義寡核苷酸分別對其目標基因GAPDH和ALB有更大的敲低效果。

其他團隊更近的研究利用我們肝臟MPS中的原代人肝細胞，探索了反義寡核苷酸的細胞攝取情況(Majeretal.,2024)。Majer等人利用多光子成像證明，與Nkd-反義寡核苷酸相比，GalNAc-反義寡核苷酸在1小時時的攝取增加。然而，在4小時時，觀察到相反的情況，即用Nkd-反義寡核苷酸處理的原代人肝細胞中，信號強度（標記的反義寡核苷酸）高于GalNAc偶聯的反義寡核苷酸。作者還區分了立方體形和非立方體形的肝細胞，并檢測了被內吞的反義寡核苷酸的運輸過程。他們發現，在立方體形肝細胞中，細胞內脂質與被內吞的反義寡核苷酸不存在共定位現象。未來的研究可以調查一種劑量-反應測定，采用更少的處理次數但使用更高濃度的新藥物模式。此外，為了研究GalNAc對其肝細胞上受體的特異性，可以引入另一種細胞類型，例如Kupffer細胞，以證明在我們的系統中使用GalNAc偶聯模式時對原代人肝細胞的偏好性。納入Kupffer細胞也有助于檢測寡核苷酸的任何免疫驅動毒性，因為這些細胞是肝臟中駐留的巨噬細胞群體的一部分。

五、結論與展望：肝臟芯片用于寡核苷酸療法體外篩選

我們的研究證明了原代人肝臟MPS和寡核苷酸遞送測定在克服非人模型局限性方面的實用性，可用于評估靶向肝臟的寡核苷酸的攝取和基因敲低效力。使用PhysioMimixCore系統和多芯片肝臟-12板，我們得以在3D膠原蛋白涂層支架上生成穩定且有功能的人體肝臟組織，用于測試小干擾RNA和反義寡核苷酸。我們的結果顯示，單次給藥時，小干擾RNA和反義寡核苷酸均能被有效攝取，且重復給藥時攝取增加。值得注意的是，與未偶聯模式相比，GalNAc偶聯的小干擾RNA和反義寡核苷酸分別對目標基因GAPDH和ALB表現出更大的敲低效果。這些發現凸顯了PhysioMimix肝臟MPS在體外測試新型治療模式方面的潛力，并強調了給藥策略在實現功能性基因敲低中的重要性。我們未觀察到蛋白質水平的敲低效應。給藥可能本會達到一個KD值，進而在細胞功能方面產生下游響應，但在此處我們給藥劑量過輕。肝臟組織細胞仍保持靶向性，但仍具活力。基于肝臟MPS的寡核苷酸測定提供了一種穩健的生理學方法，可在初次人體試驗前進行寡核苷酸療法的測試，并可作為動物體內模型的替代方案。

本文基于CNBio公開研究資料由其中國供應商上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供完整的器官芯片實驗解決方案及相關產品技術支持，可掃描下方圖片查看。

文獻參考

[1] J.Debackeretal.,(2020).Mol.Ther.28(8):1759-1771

[2] K.J.Livak&T.D.Schmittgen(2001),Methods.25(4):402-408

[3] J.Majeretal.,(2024).Lab.Chip.24(19):4594-4608

[4] T.C.Robertsetal.,(2020).Nat.Rev.DrugDiscov.19(10):673-694

[5] Rubianoetal.,(2021).Clin.Transl.Sci.14(3):1049-1061