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一、引言

在藥物研發階段，新型化合物對主要細胞色素P450（CYP）酶的體外誘導潛能評估是關鍵環節，傳統方法多采用三明治培養的原代人肝細胞（PHH）。盡管PHH結合監管指南往往能較合理地預測臨床誘導風險，但對于新一代的肝細胞模型在CYP誘導評估中的表現，目前仍缺乏充分認知。

本研究評估了一種新型的全人源肝細胞三培養系統(TCS)，用于檢測主要CYP和核受體的基礎表達水平，以及在原型誘導劑處理后CYP的誘導水平。這些結果將為TCS在體外誘導研究中的進一步應用提供基礎數據支持，并為探索TCS能否克服PHH存在的相關挑戰（如CYP2C酶誘導評估難題）提供重要參考。

二、材料與方法

1、4周培養期內基因基礎表達水平的評估

• 將原代人肝細胞（PHH）和飼養細胞接種到24孔膠原包被板上，構建三培養體系（TCS）；

• 在4周培養期內的特定時間點，向孔中加入Trizol試劑裂解細胞；

• 采用氯仿萃取法分離RNA，使用SuperScript IV VILO試劑盒合成cDNA；

• 使用QuantStudio7實時熒光定量PCR系統上的TaqMan芯片檢測法評估基因表達。與第1天的表達量相比，使用ΔΔCt法計算倍數變化。

2、評估CYP表達對原型誘導劑的反應

1. 將原代人肝細胞（PHH）和飼養細胞接種到96孔膠原包被板上，構建三培養體系（TCS）；

2. 培養至第10天，向孔中加入含不同濃度原型誘導劑（含0.1%二甲基亞砜）的培養基（表1）；

3. 細胞暴露于誘導劑48小時，前24小時后更換新鮮培養基和誘導劑；

4. 48小時后，移除培養基，使用mRNA Catcher PLUS純化試劑盒收集各孔中的RNA；

5. 采用Super Script IV VILO試劑盒合成cDNA，通過QuantStudio7實時熒光定量PCR系統結合TaqMan探針檢測法評估基因表達水平，采用ΔΔCt法計算相對于溶媒對照組的倍數變化；

6. 使用GraphPad Prism軟件，通過S型曲線擬合數據來確定Emax和EC??值。

表1.針對陽性誘導劑處理后誘導潛能評估的CYP酶列表

表2.肝細胞供體（1921756）信息

三、結果

1、三培養體系（TCS）研究中內參基因的篩選

結果顯示，各內參基因的Ct值存在差異（圖1）。其中GAPDH在培養期間的Ct值具有良好的一致性，因此被選為理想的內參基因。

圖1.4周培養期內各內參基因表達水平的評估。每個圓點代表第1、4、7、12、17、23或30天的基因表達水平。

表3.各內參基因的Ct值統計數據

2、4周培養期內TCS中CYP酶和核受體的基礎表達水平

如圖2所示，在TCS建立后的4-12天內，除CYP1A1和CYP2E1外，其余CYP酶和核受體的表達水平均明顯升高。大多數受測基因的表達水平在培養第7-12天達到峰值，因此后續的誘導研究選擇在培養第10天啟動。

圖2.在基礎培養條件下，于4周培養期內的不同時間點檢測TCS中各CYP酶和核受體的基因表達水平。

3、原型誘導劑暴露48小時后主要CYP酶的誘導潛能

經不同濃度原型誘導劑處理48小時后，TCS中所有主要CYP酶均表現出明顯的誘導潛能，包括CYP2C家族各亞型（圖3）。各酶的最大誘導倍數（E???）和半數效應濃度（EC??）數據見表4。此外，在所有主要CYP酶的測試中，當誘導劑濃度達到最高值時，誘導潛能均呈現下降趨勢。

圖3.三培養體系（TCS）經不同濃度的多種原型誘導劑處理48小時后，檢測各CYP酶的基因表達水平。表達水平以相對于溶媒對照組的倍數變化表示（n=4），通過將曲線限定在觀察到的最高倍數變化值，確定各酶的最大誘導倍數（E???）和半數效應濃度（EC??）

表4.各CYP酶的最大誘導倍數（E???）和半數效應濃度（EC??）

四、結論

1. TCS建立后的4-12天內，除CYP1A1和CYP2E1外，CYP酶和核受體的表達水平明顯升高；

2. 大多數受測基因在TCS中的表達水平于第7-12天達到峰值；

3. 主要CYP酶在TCS中均對原型誘導劑具有高度誘導性，包括CYP2C酶；

4. 在主要CYP酶的測試中，當誘導劑濃度達到最高值時，誘導潛能均有所下降。

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