原代人肝細胞三培養體系（TCS）及長期培養方法

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一、引言

原代人肝細胞（PHHs）在臨床前藥理學和毒理學研究中的應用受到一定限制，部分原因是缺乏便捷的合適培養體系。該體系需要具備以下特點：操作簡便，能夠支持來自健康和病變組織的多種供體細胞，并能長期維持細胞的結構和功能特性。三明治培養（SC）體系和共培養體系雖已解決部分此類問題，但仍存在局限性。

為突破這些局限，本研究開發了一種全人源三培養體系（TCS），采用原代人肝細胞（PHHs）和原代飼養細胞（FCs）。實驗流程如下：將由兩種基質細胞按1:1比例組成的凍存人源飼養細胞解凍后，接種到24孔膠原包被板中；然后，將冷凍保存的成人PHH解凍后接種于飼養細胞上，從而構建三重培養系統(TCS)。

在為期3周的培養中，研究評估了細胞的形態與功能，包括白蛋白（Alb）分泌、尿素分泌及細胞色素P450（CYP）活性。結果顯示：

1. 來自多個成人供體的原代人肝細胞在TCS中可維持健康穩定的形態（包括多細胞簇形成）長達42天；

2. 培養初始5天內，細胞形成交織的膽小管網絡，且該網絡具有緊密連接和縫隙連接，在后續培養中持續穩定；

3. 與三明治單培養體系（SC）中的PHHs相比，TCS中PHHs的白蛋白（30-40μg/天/10?細胞）和尿素（55-70μg/天/10?細胞）生成水平明顯更高；

4. 培養第4天，TCS中PHHs的Alb、CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4基因表達水平，平均比SC體系中的PHHs高2倍；

5. 第5天后，Ⅰ相和Ⅱ相代謝功能（1-羥化速率：10-20pmol/分鐘/10?細胞；7-EC葡萄糖醛酸化速率：300-600pmol/分鐘/10?細胞）穩定維持至少2周。

綜上，三培養模型是一種便捷的全人源肝細胞培養體系，可在數周內同時維持肝細胞的形態與代謝功能。

二、材料與方法

1、背景與體系優勢

當前，尋找能模擬體內肝臟微環境的培養模型仍面臨局限，核心問題是肝細胞難以長期維持形態與功能特性?1?。盡管動物模型可用于相關研究，但肝臟代謝和受體信號通路存在物種差異?2?；單培養和三明治培養體系也存在嚴重不足，如細胞極性和代謝功能在短期至中期內喪失?3?。

現有共培養和三培養模型雖將肝細胞與一種或多種飼養細胞結合，但多采用非人源飼養細胞（主要為小鼠或大鼠來源）???。本研究新開發的TCS體系則采用兩種不同類型的凍存原代人源飼養細胞和PHHs，且凍存細胞試劑盒組件使用便捷，便于研究人員在標準平板格式中控制實驗流程，數小時內即可完成體系搭建，適用于需維持肝細胞極性和表型的多種實驗場景。

2、實驗流程

圖1：三培養體系搭建步驟

1. 培養基制備：①過夜解凍；②添加補充劑；③升溫至37℃（耗時30分鐘）；

2. 飼養細胞接種：解凍、計數并接種FCs（耗時60分鐘）；

3. 原代人肝細胞接種：解凍、計數并接種PHHs（耗時2-4小時）；

4. 培養基更換：每日更換培養基。

三、檢測方法

1. 蛋白表達檢測：通過免疫細胞化學法檢測ZO-1、Connexin-32、CK18、白蛋白（Alb）、CYP1A2和VIM（波形蛋白）的表達；使用DAPI進行細胞核復染；使用5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(5µM)(CDFDA)對膽小管進行染色。（圖3A：第14天TCS中膽小管的CDFDA染色結果，及ZO-1、Connexin-32、CK18的陽性染色）。

2. 基因表達檢測：用RLT緩沖液裂解細胞，通過RNeasyMini試劑盒提取總RNA，使用QuantiNovaSYBRGreenRT-PCR試劑盒制備cDNA；在StepOnePlusRT-PCR系統上進行PCR擴增，并使用StepOne軟件進行分析。以GAPDH為內參基因，采用2-??CT法計算相對表達量。

3. 白蛋白與尿素檢測：收集細胞上清液，通過ELISA試劑盒檢測白蛋白含量，采用比色法測定尿素合成量（圖4C、D：TCS中PHHs在22天培養期內的Alb和尿素水平；圖5A、B：第7天和第14天SC單培養與TCS中Alb、尿素的對比）。

4. CYP酶活性檢測：分別用奧美拉唑（100μM）、CITCO（100nM）和利福平（25μM）誘導PHHs48小時后，采用P450-Glo檢測試劑盒（Promega）測定CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的活性（圖2B：第4天和第7天不同PHHs:FCs比例下CYP1A2的誘導活性；圖4B：42天培養期內TCS與SC中PHHs的CYP3A4誘導活性對比；圖6：TCS中CYP1A2、2B6、3A4的誘導情況及相關基因表達）。

5. Ⅰ相代謝檢測：通過液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）測定（OH-MDZ）的濃度，評估Ⅰ相代謝功能（圖5C：第5、7、10、14天OH-MDZ的生成量；下表2：飼養細胞對OH-MDZ生成的貢獻，各時間點均值均為0）。

6. Ⅱ相代謝檢測：將細胞暴露于100μM（7-EC，Sigma），孵育30（60）分鐘后收集樣本；通過LC-MS/MS分析（7-HC，Ⅰ相代謝產物）、（7-HCG）和（7-HCS，均為Ⅱ相代謝產物）的生成量（圖5D：14天培養期內3種代謝產物的變化）。

表1.原代人肝細胞供體信息表

四、結果與結論

1. 形態穩定性：TCS中的PHHs在無膠原或基質膠包被的情況下，體外可維持肝細胞形態長達42天，且形成具有緊密連接和縫隙連接的交織膽小管網絡（圖3：TCS中膽小管形成及蛋白標志物表達；圖4A：42天培養期內SC單培養與TCS（無基質膠）的形態對比）。

2. 功能穩定性：測定Alb和尿素水平顯示，TCS中的PHHs在超過22天的培養期內保持功能穩定；與SC單培養相比，TCS中PHHs的Alb、尿素生成量及CYP活性明顯更高（圖4C、D；圖5A、B）。

3. 代謝穩定性：第5天后，TCS中PHHs的Ⅰ相（如OH-MDZ生成）和Ⅱ相（如7-HCG、7-HCS生成）代謝功能穩定維持至少2周；基于CYP和尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）的酶活性及核受體在此期間也保持穩定（圖5C、D）。

4. 供體適用性：來自多個成人供體的PHHs在TCS中均能維持健康形態與功能，且不同供體（如E、F、G）的CYP3A4誘導活性在16天培養期內持續穩定（圖6B）。

因此，三培養體系（TCS）是一種便捷、穩定且可重復的體系，適用于藥物研發和風險評估中的藥理學與毒理學研究。

結論

• TCS中的原代人肝細胞（PHHs）在無膠原或基質膠（Matrigel）包被的情況下，體外可維持肝細胞形態長達42天。

• 該體系中的原代人肝細胞形成了具有緊密連接和縫隙連接的交織膽小管網絡。（圖3：TCS中膽小管形成及蛋白標志物表達；）

• 當以白蛋白（Alb）和尿素水平為檢測指標時，三培養體系中的原代人肝細胞在超過22天的時間內保持功能穩定。

• 與三明治單培養體系（SC）中的原代人肝細胞相比，三培養體系中的原代人肝細胞具有明顯更高的白蛋白（Alb）生成量、尿素生成量及細胞色素P450（CYP）活性。

• 在此期間，基于細胞色素P450（CYP）和尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）的酶活性以及核受體也保持穩定。

表2：飼養細胞對OH-MDZ生成的貢獻

圖2.三培養體系（TCS）中適宜原代人肝細胞（PHHs）與飼養細胞（FCs）比例

（A）第4天和第7天，不同接種密度（1.5:1、3:1、6:1）的原代人肝細胞（PHHs）與飼養細胞（FCs）的代表性圖像；

（B）第4天（灰色柱）和第7天（黑色柱）細胞色素P4501A2（CYP1A2）的誘導水平與未誘導組原代人肝細胞（PHHs）的對比。誤差線代表標準差（n≥3個復孔）。放大倍數10倍。

圖3.三培養體系（TCS）中膽小管的形成及蛋白標志物的表達

（A）第14天對膽小管進行CDFDA染色的結果；ZO-1（緊密連接蛋白1）、連接蛋白-32（Connexin-32）及細胞角蛋白18（CK18）均呈陽性染色；

（B）三培養體系（TCS）中原代人肝細胞（PHHs）的白蛋白（Alb）和細胞色素P4501A2（CYP1A2）呈陽性表達；飼養細胞（FCs）經波形蛋白（Vimentin，縮寫Vim）染色呈陽性。放大倍數10倍。

圖4.三培養體系（TCS）的長期穩定性

（A）42天培養期內，三明治單培養體系（SC）與無基質膠（Matrigel）包被的三培養體系（TCS，-MG）的代表性圖像（D42表示第42天）；

（B）42天培養期內，三培養體系（TCS，黑色柱）中原代人肝細胞（PHHs）的CYP3A4誘導活性與三明治單培養體系（SC，灰色柱）的對比；

（C）22天培養期內，三培養體系（TCS）中原代人肝細胞（PHHs）的白蛋白（Alb）水平；

（D）22天培養期內，三培養體系（TCS）中原代人肝細胞（PHHs）的尿素水平。

誤差線代表標準差（n≥3個復孔）。放大倍數10倍。

圖5.三培養體系（TCS）中原代人肝細胞（PHHs）的功能驗證

（A）第7天（灰色柱）和第14天（黑色柱），三明治單培養體系（SC）與三培養體系（TCS）中原代人肝細胞的白蛋白（Alb）水平；

（B）第7天（灰色柱）和第14天（黑色柱），三明治單培養體系（SC）與三培養體系（TCS）中原代人肝細胞的尿素水平；

（C）以（1-hydroxymidazolam，縮寫OH-MDZ）為檢測指標，于第5天、第7天、第10天和第14天測定Ⅰ相代謝功能；

（D）14天培養期內，對Ⅰ相代謝產物（7-hydroxycoumarin，縮寫7-HC，灰色圓圈）及Ⅱ相代謝產物（7-hydroxycoumaringlucuronide，縮寫7-HCG，黑色圓圈）、（7-hydroxycoumarinsulfate，縮寫7-HCS，黑色三角形）的生成情況進行檢測。***p≤0.001，與第14天三明治單培養體系（SC）相比具有更明顯的統計學差異。

圖6.三培養體系（TCS）中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4的誘導情況

（A）第4天，三培養體系（TCS）與三明治單培養體系（SC）中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4誘導水平的對比表；

（B）將3個不同供體的原代人肝細胞樣本（E、F、G樣本）在三培養體系（TCS）中培養16天，分別于第4天（灰色柱、黑色柱）、第10天（條紋柱）和第16天（白色柱、格子柱）測定未誘導組（灰色柱、水平條紋柱、白色柱）和CYP3A4誘導組（黑色柱、垂直條紋柱、格子柱）的酶活性；

（C）第4天，三培養體系（TCS，黑色柱）中原代人肝細胞（PHHs）的白蛋白（Alb）、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4及載脂蛋白1（Apolipoprotein1，縮寫APOA1）的基因表達水平，與三明治單培養體系（SC，灰色柱）中原代人肝細胞的基因表達水平對比。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，與三明治單培養體系（SC）相比具有統計學差異。誤差線代表標準差（n≥3個復孔）。

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參考文獻

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