Qkine與REPROCELL合作：Alvetex支架與生長因子生成全層人體皮膚等效物

摘要：本文介紹歐洲REPROCELL公司與Qkine公司合作開展的一項研究，旨在評估Alvetex支架技術與高純度重組生長因子聯合應用，對優化皮膚模型構建及提升其可重復性的效果。

關鍵詞：Qkine、REPROCELL、Alvetex、TGF-β1 PLUS、KGF、全層人體皮膚等效模型、REPROSKIN、細胞外基質、皮膚模型

注：本研究由杜倫大學、歐洲瑞博賽爾（REPROCELL）與Qkine合作研究發布

引言

皮膚是一種復雜的多層器官，構成一道完整屏障，抵御物理、化學及病原體侵襲。從結構上看，皮膚主要分為兩大組織區域：表皮，主要由角質形成細胞構成的復層上皮組織；真皮，富含細胞外基質與成纖維細胞的支撐性結構結締組織層[1]。

人工構建的人體皮膚等效模型是科研、臨床及工業領域的重要工具。它可作為傳統體外二維細胞培養與體內動物模型的有效替代方案，后兩者通常難以準確模擬人體解剖結構與生理功能。依據英國國家實驗動物替代、優化與減少研究中心（NC3Rs）及歐盟（化妝品法規 EC 1223/2009）等機構的原則與指導要求，臨床前化合物評價正逐步擺脫對動物模型的依賴 [2,3]。因此，構建具有生理相關性的模型對推動皮膚病學研究發展很重要。然而，由于人體皮膚在細胞組成與結構上高度復雜，想要建立穩定、可重復且能準確模擬天然組織生物學特性的體外模型具有挑戰性。

REPROCELL公司的Alvetex支架為構建人工皮膚模型提供了優質工具，無需使用外源性合成或動物源細胞外基質成分。Alvetex是一種高孔隙率、惰性聚苯乙烯膜，其結構可支持細胞自然浸潤與增殖，并實現三維（3D）營養物質擴散。這一獨特結構使真皮成纖維細胞能夠以三維方式生長，從頭合成并沉積細胞外基質，形成在結構與生化特性上均接近天然人體皮膚的真皮等效體（DE）。

REPROCELL公司利用該技術開發了REPROSKIN產品：一種商業化、穩定且可重復的全層皮膚模型。將人原代角質形成細胞接種于真皮等效體的上表面，可在真皮 - 表皮連接處形成富含 Ⅳ 型膠原的基底膜。角質形成細胞隨后增殖、分化、復層化并角質化，形成具有完整結構的多層表皮組織，包含基底層、棘層、顆粒層與角質層，重現天然人體皮膚的體內結構 [4]。為維持細胞活性、促進細胞生長、分化與成熟，REPROSKIN采用專用培養基培養，并添加重組細胞因子與生長因子。

Qkine是一家專注于重組蛋白生產的企業，其產品為無動物源、高生物活性的生長因子與細胞因子，其中包括目前市面的無動物源重組轉化生長因子-β1（TGF-β1）。Qkine生長因子具備批間生物活性一致性、高純度與無菌性保障，是復雜三維組織培養的理想選擇。曼博生物是Qkine在中國授權提供商，如果需要歡迎您咨詢QKine中國直售提供商上海曼博生物。

本文將介紹歐洲REPROCELL公司與Qkine公司合作開展的一項研究，旨在評估Alvetex支架技術與高純度重組生長因子聯合應用，對優化皮膚模型構建及提升其可重復性的效果。

材料與方法

1. 全層人體皮膚等效模型的構建

• 置于6孔板中的12孔式Alvetex支架插入式小室，依次經70%乙醇、無菌PBS及培養基（每孔10ml）清洗后，用于細胞接種。

• 將12孔式Alvetex支架插入式小室置于6孔板中，依次經70%乙醇、無菌PBS及培養基（每孔10ml）清洗后，用于細胞接種。

• 將原代人真皮成纖維細胞（HDFn；第4～7代）以每孔 0.5×10?個的密度，接種于支架膜上，接種體積為100μl 維持培養基1；在37℃、5% CO?的飽和濕度培養箱中孵育2小時，以促進細胞黏附于支架。隨后將小室浸入培養基1（每孔10ml），繼續培養18天；每3～4天更換一次培養基。真皮等效體培養體系中添加Qkine TGF-β1 PLUS（轉化生長因子β1；Qk010），以促進細胞從頭合成并沉積細胞外基質。

• 在真皮成纖維細胞培養的第19天，吸去各孔培養基1。將原代人表皮角質形成細胞（HEKn；第4代）以每孔 1.3×10?個的密度，接種于支架小室的上表面，接種體積為200μl維持培養基 2；在37℃、5% CO?的飽和濕度培養箱中孵育2小時，促進細胞黏附于真皮等效體。隨后將模型浸入培養基2（每孔10ml），繼續培養48小時。

• 為促進角質形成細胞分化與分層，在角質形成細胞接種第3天，將模型提升至氣-液界面（ALI）進行培養。吸去小室基底側與頂端的培養基2，將每個小室轉移至 Alvetex 支架托架與深層培養皿（AVP015-2；AVP015-10）中，采用中位懸掛方式培養，每皿可放置3個模型。向模型小室的基底側加入培養基3（每皿30ml）。隨后繼續培養14天，再用于后續實驗；每3～4天更換一次培養基。培養結束后收集樣本，用于下游分析。全層人體皮膚等效模型培養體系中添加Qkine KGF（角質形成細胞生長因子；Qk046），以維持角質形成細胞活性并促進其分化。

2. 培養基配方

a. 維持培養基1（成纖維細胞培養基）：

DMEM 培養基，添加 10%（v/v）胎牛血清、100 U/ml 青霉素 / 鏈霉素及 2 mM L-谷氨酰胺。

b. 維持培養基2（角質形成細胞培養基）：

GibcoEpilife培養基（含 60 mM CaCl?），添加 1%（v/v）Gibco人角質形成細胞生長添加物（HKGS）及 100 U/ml 青霉素 / 鏈霉素。

c. 培養基1（真皮等效體培養基，DE medium）：

成纖維細胞培養基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸及 5 ng/ml TGF-β1 PLUS（Qkine；Qk010）。

d. 培養基2（全層皮膚培養基，FTS medium）：

角質形成細胞培養基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸、140 mM CaCl?及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。

e. 培養基3（氣液界面培養基，FTA medium）：

角質形成細胞培養基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸、1.64 mM CaCl?及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。

結果

1. TGF-β1 PLUS可促進真皮等效體形成

首先將原代人真皮成纖維細胞與 Alvetex 支架膜共培養 19 天，完成真皮等效體的構建。實驗全程添加Qkine 重組 TGF-β1 PLUS（Qk010），以支持成纖維細胞增殖及從頭合成細胞外基質（ECM）。H&E染色的組織學分析顯示：成纖維細胞充分浸潤支架膜并呈均勻分布（圖 1A）。在整個培養周期內，成纖維細胞均保持良好活性，并呈現細長梭形的典型形態。

隨后將原代人表皮角質形成細胞接種于真皮等效體的上表面，繼續培養 16 天。H&E 染色結果證實：該真皮等效體可提供充足的力學與生化支撐，維持上層表皮組織層的形成，最終構建出全層人體皮膚等效模型（圖 1B）。針對真皮基質標志物Ⅰ 型膠原（collagen-I）與纖連蛋白（fibronectin）的免疫熒光染色結果表明：經 Qkine 重組 TGF-β1 PLUS（Qk010）處理的真皮成纖維細胞，可在支架膜內內源性從頭合成并沉積細胞外基質成分（圖 1C、圖 1D）。

圖1. 添加 TGF-β1 PLUS可促進細胞外基質沉積，并助力全層皮膚等效模型中真皮-表皮結構分區的形成。

（A）成纖維細胞培養前 19 天全程添加 Qkine TGF-β1 PLUS后，真皮等效體的代表性蘇木精-伊紅（H&E）顯微圖像；

（B）全層皮膚等效模型的代表性 H&E 顯微圖像；

（C、D）全層皮膚等效模型真皮層內 Ⅰ 型膠原（C，綠色）與纖連蛋白（D，綠色）的代表性免疫熒光顯微圖像，顯示大量細胞外基質沉積。細胞核用 Hoechst 33342 復染（藍色）。比例尺 = 50 μm。

為評估 Qkine TGF-β1 PLUS（Qk010）相較于其他供應商產品的生物活性，我們對真皮等效體結構內的總膠原沉積量進行了定量檢測。在相同添加濃度的培養基條件下，TGF-β1 PLUS可明顯上調人真皮成纖維細胞的膠原合成水平，并增強支架結構內的細胞外基質（ECM）沉積（圖 2）。綜上結果表明：Qkine TGF-β1 PLUS可用于提升三維組織模型的構建效率與質量。

圖2. 與競品相比，使用 TGF-β1 PLUS培養的真皮等效體（DE）總膠原沉積量更高。

在成纖維細胞培養第 19 天收集真皮等效體，通過羥脯氨酸定量法（Quickzyme, Leiden, Netherlands）測定總膠原含量。在相同濃度條件下，與使用其他品牌 TGF-β1 培養的模型相比，添加 Qkine TGF-β1 PLUS的模型具有更高的膠原含量。

2. 添加KGF可支持表皮分化與成熟

將角質形成細胞接種至真皮層后，模型在添加KGF（FGF-7；Qk046）的生長培養基中繼續培養。H&E染色結果顯示，模型成功形成多層表皮結構，在真皮等效體上方清晰呈現出基底層、分化層及角質化層的角質形成細胞分層（圖 3A）。角蛋白 14（Keratin-14）特異性定位于基底角質形成細胞，而角蛋白 10（Keratin-10）在基底上層細胞中高表達，進一步證實形成了結構規整、分化成熟的表皮組織層（圖 3B）。

圖3. 添加 KGF 可促進角質形成細胞分層與分化。

（A）經 Qkine KGF 培養的全層皮膚等效模型表皮層代表性蘇木精-伊紅（H&E）顯微圖像。

（B）角蛋白 10（K10，綠色）與角蛋白 14（K14，紅色）代表性免疫熒光顯微圖像，顯示中間絲蛋白的特異性定位。細胞核用 Hoechst 33342 復染（藍色）。比例尺 = 50 μm。

在添加 KGF（FGF-7；Qk046）培養后，通過檢測全層皮膚模型表層的經表皮水分流失（TEWL），客觀評估其完整屏障功能。TEWL數值與天然人體皮膚的已發表數據一致，表明該模型系統具有良好的生理相關性（圖 4）[5]。

圖4. 采用Qkine添加因子與生長因子構建的全層皮膚等效模型可形成完整的表皮屏障。

使用 VapoMeter 探頭（Delfin Technologies, Kuopio, Finland）在表皮層頂端表面測定經表皮水分流失量（TEWL）。測得數值與天然人體皮膚相近。

結論

在REPROSKIN模型構建全程中，使用Qkine高純度、準確定性的生長因子進行添加，可有效支持細胞分化與組織結構形成。TGF-β1 PLUS可促進真皮層構建，而 KGF（FGF-7） 則有助于角質形成細胞增殖與分層。

綜上，本合作研究建立了一套有價值的體外研究系統，可用于皮膚相關的學術研究、工業研發及商業化應用。

關于Qkine品牌

QKine總部位于英國劍橋，是一家通過ISO9001:2015認證的公司。作為蛋白質創新的指引者，產品范圍涵蓋了多個應用領域，旨在提高您研究的可重復性。QKine積極支持并創新于新興領域，如類器官和器官芯片、細胞農業、再生醫學、合成水凝膠和生物打印等。

憑借制造流程，QKine生產高純度、高品質、無動物成分的生長因子、細胞因子和其他復雜蛋白質，其中約30%的產品目錄由獨特的產品組成，包括無標簽的熱穩定FGF-2 (FGF2-G3)，頭個無動物、化學成分限定的TGF-β1，用于的干細胞培養基，以及無動物成分的HGF (NK1)。

QKine可以通過提供批量預訂、批量訂單、定制裝瓶和質量保證（QA ）來支持規模化和商業制造。

Qkine細胞因子推薦閱讀，可訪問曼博生物網站

• Qkine｜iPSC向三胚層分化系列-中胚層

• Qkine iPSC：神經系列分化試劑盒

文獻參考

[1] Zaidi Z and Lanigan SW. Skin: Structure and Function. 2010, Springer London. p. 1-15. doi: 10.1007/978-1-84882-862-9_1

[2] Burden N et al. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). J Am Assoc Lab Anim Sci, 2015. 54(2): p. 198-208. PMID: 25836967

[3] Filaire E et al. Alternative in vitro models used in the main safety tests of cosmetic products and new challenges. International Journal of Cosmetic Science, 2022. 44(6): p. 604-613. doi: 10.1111/ics.12803

[4] Roger M et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy, 2019. 234(4): p. 438-455. doi: 10.1111/joa.12942

[5] Green M et al. TransepidermalWater Loss (TEWL): Environment and Pollution—A Systematic Review. Skin Health and Disease, 2022. 2(2). doi: 10.1002/ski2.104

您可進入曼博生物QKine產品頁，詳細了解QKine細胞因子每款產品。若您對QKine細胞因子感興趣，歡迎咨詢上海曼博生物。

本文基于Qkine公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供Qkine TGF-β1 PLUS、KGF、生長因子、細胞因子及相關產品與技術支持，助力全層人體皮膚等效模型、類器官、器官芯片及再生醫學相關研究。