一、MSC、EVs和衰老背后的生物學

《傳道書》中的智者曾感嘆：“日光之下并無新事。"然而，有一件事在千百年來始終未曾改變，那就是人類渴望延緩衰老和死亡的步伐。或許我們無法阻止衰老的發生，但至少可以減少因衰老而帶來的疾病和痛苦。現代醫學和科技的進步為這一目標提供了希望，尤其是間充質干細胞（MSCs）在衰老研究中的潛力，成為了當下的研究熱點。

間充質干細胞（MSCs）是多能干細胞，能夠分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞，甚至可能分化為其他幾種細胞類型。

圖1. The Mesengenic Process。間充質發生過程，闡釋間充質干細胞（MSC）可以被誘導進入幾種不同間充質譜系路徑中。圖片來源于文章DOI 10.1016/j.stem.2011.06.008

MSCs 具有較強的自我更新能力，并能進行多輪細胞分裂，這些干細胞儲存在人體內，直到因受傷或疾病的需要被召回并“激活"。一旦被激活，MSCs 會參與修復過程，填補受損的血管，向疲憊的修復細胞捐贈線粒體，并分化為骨、軟骨、脂肪或成纖維細胞。這些細胞的分泌物（secretomes）包括細胞因子、生長因子和細胞外囊泡（EVs，尤其是外泌體），這些成分具有抗炎作用和促血管生成作用，能夠引導一系列有序的創傷修復和再生細胞活動。

圖2. 間充質干細胞具有免疫調節和營養支持作用。圖片來源于文章DOI 10.1016/j.stem.2011.06.008

隨著年齡的增長，人體內的細胞逐漸受損，尤其是基因組和線粒體等結構的退化。細胞會隨著時間的推移逐漸積累損傷，導致功能的下降，直到觸發細胞的凋亡。衰老細胞常被稱為“僵尸細胞"，它們會分泌與衰老相關的因子，促進局部的炎癥反應和纖維化，影響周圍健康細胞的功能。近年來的研究發現，去除這些衰老細胞或清除它們的分泌因子，甚至通過引入新的年輕或健康的細胞來替代受損細胞，可能成為減緩衰老相關慢性疾病發展的有效策略。

間充質干細胞（MSCs）正是這種潛力的體現。MSCs 對組織培養的適應性和自身的強韌性，使其成為理想的支持細胞，能夠在多細胞類型的組織工程支架中發揮重要作用，例如用于心肌、肝臟、角膜、氣管、主動脈及皮膚等多種組織的修復和再生。通過 MSCs 和它們的分泌物，或許能在不改變生物學極限的情況下，減緩衰老進程，延緩衰老相關疾病的發生。

圖3. 細胞外囊泡(EVs)的異質性。細胞外囊泡（EVs）是異質的、由磷脂膜包裹的結構。根據其生物發生機制，主要將EVs分為兩種類型，分別為外泌體（exosomes）和外源性囊泡（ectosomes）。參考原文可咨詢上海曼博生物

二、大規模EVs制造探索

近年來，hMSC-EVs 的需求急劇增加，突顯了對可放大生物反應器的大規模生物制造的需求。然而，EVs 的生物發生過程對體外培養微環境敏感。接下來小編將分享一篇近期的研究，主題是關于 “不同培養方式下的外泌體生產效率研究、以及EVs質量和功能如何"的研究。這里可以將MSCs分泌的EVs理解為“小包裹"，里面裝著脂質、蛋白質、核酸等這些對身體有用的 “治療物質"。 但之前的問題是：這種 “小包裹" 產量太低，沒法滿足臨床治療的需求，所以需要找到能 “大規模生產" 它們的方法。

1、不同培養方式下的EVs生產效率研究

研究團隊找了4種不同的 “培養方式"，來養脂肪來源間充質干細胞，看看哪種能產出更多、更好的EVs：

1. 2D 平面培養：就像在孔板里養細胞，是以前常用的方式；

2. ULA 3D靜態聚集體培養：在特殊盤子里讓細胞聚成團養，但不怎么動；

3. SFB 動態3D培養（微載體依賴）：一種能旋轉的設備，讓細胞在里面動態培養；

4. VWBR 動態3D培養（聚集體，無微載體）：攪拌機制優化的動態設備，提供相對溫和均勻可控的流體動力學環境，讓細胞在更舒適的體外環境中培養。

圖4. 實驗流程示意圖。(A) 實驗流程圖，包含生物反應器設置、取樣日期和實驗概覽。實驗中用的Synthemax II 微載體。具體接種細胞數、接種效率、接種密度可參考原文。 (B) 實驗生物反應器、靜態聚集體對照組和二維對照組示意圖。圖中展示了hMSC的接種過程及收集的EVs。

之后研究團隊做了三件關鍵的事：

1. 收集各種培養方式下干細胞分泌的 “小包裹"- EVs，測一測產量（多少個）、大小，還有和 “小包裹生成" 相關的基因有沒有更活躍；

2. 測試這些 “小包裹" 的功能：比如能不能減少細胞的 “氧化應激"（相當于身體里的 “自由基傷害"）、能不能抑制炎癥（比如減少導致炎癥的 “壞因子" TNF-α）；

3. 模擬疾病場景測試：在類似阿爾茨海默病的模型里，看看 “小包裹" 能不能減少神經退化；還嘗試把 “小包裹" 包在水凝膠里送進細胞，看看這種 “遞送方式" 能不能提高抗炎效果。

2、關鍵結果：發現了啥有用的結論？

（1）動態生物反應器（尤其是 VWBR）比傳統 2D 培養 “多產" 多了：

• VWBR 產出的EVs 總量，比 2D 培養多了 1 倍多；比旋轉瓶反應器也多出30%左右；

• 不管是每毫升培養基、還是平均每個干細胞產出的EVs都比 2D 培養多，而且相關的 “生成基因" 也更活躍（見原文）。

圖5. 不同培養系統中細胞外囊泡的分泌情況，由納米顆粒追蹤分析（NTA）表征

(A) 從NTA計算得出的總EV產量。

(B) 按照培養基生產力歸一化的EV產量（單位為每毫升培養基中的EV顆粒數）。結果顯示，在SFB組中單位培養基生產力明顯提高，幾乎增加了2倍，而在VWBR組中則增加了3倍。

(C) 按照細胞生產力歸一化的EV產量（單位為接種時D0的細胞計數下的EV顆粒數）。N = 3；* p < 0.05，** p < 0.01。EV的尺寸以均值 + 標準差表示。

EV尺寸分布圖：(D) 平均尺寸；(E) 眾數尺寸；(F) 中位尺寸。(G) 2D樣本；(H) SFB；(I) VWBR。

（2）“小包裹" EVs的體外功能分析：  

• 能明顯減少 “氧化應激" 和炎癥，比如在模擬阿爾茨海默病的模型里，能降低炎癥因子，還能減少神經退化的標志；

圖6. 在Aβ42寡聚體或阿爾茨海默病（AD）類器官培養基處理下，hMSC EVs的體外功能性實驗。

(A) 電子傳輸顯微鏡（TEM）圖像顯示EVs。尺度條：60 nm。

(B) 四種不同EV樣本的外泌體標志物Western blot分析。

(C) TNF-α分泌的ELISA分析。(I) Aβ42寡聚體增加了hMSC的TNF-α分泌；(II) EV處理Aβ42寡聚體刺激的細胞；

(D) 暴露于APOE4阿爾茨海默病（AD）相關腦類器官培養基的iPSC來源的圍繞細胞（iPCs）。評估了hMSC EV處理對反應性氧種（ROS）生成的影響。(I) ROS定量；(II) ROS圖像。尺度條：50 μm。*p < 0.05；*** p < 0.001。

圖7. 在阿爾茨海默病（AD）類腦器官培養基處理下，hMSC EVs對iPCs神經炎癥和神經退行性標志物表達的影響。基因表達通過RT-qPCR進行測定。

(A) 炎癥標志物；(B) 抗炎標志物；(C) 神經退行性標志物。N = 3。p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001，與對照組（無AD培養基和無EVs）比較。

• 把“小包裹"包在水凝膠里遞送，抗炎效果更好（能阻止炎癥相關的 NF-κB 信號激活）。（數據可見原文章）

三、總結

hMSCs 及其分泌的 EVs 因具有免疫調節和組織修復潛能，在退行性、炎癥性疾病治療中備受關注，但傳統 2D 培養的 EVs 產量低，難以滿足臨床需求。文中分享的研究探究了在不同培養體系（尤其是可擴展生物反應器）對脂肪來源 hMSCs 分泌 EVs 的影響，同時驗證 EV 的生物學功能，為 hMSC-EVs 的大規模生產和臨床應用提供依據。提示生物反應器微環境（如流體動力學、剪切應力）可能通過調控 EVs 生物合成基因表達影響 EVs 產量，為進一步優化培養體系提供了理論基礎。

本文內容基于細胞外囊泡,干細胞外泌體,垂直輪生物反應器,大規模生產,抗衰抗炎,阿爾茨海默病,AD,EVs公開研究資料，由MSC研究方案提供商上海曼博生物整理發布，歡迎掃描下方圖片或者直接咨詢曼博生物。