關鍵詞：iPSC、誘導多能干細胞、iPSC 規模化接種、生物反應器、PBS 垂直輪生物反應器、PBS Mini 生物反應器、iPSC 聚集體、誘導多能干細胞（iPSC）、3D 聚集體培養、細胞傳代

摘要：本文拆解 PBS Mini 反應器中 iPSC 3D 聚集體的標準化接種工藝，提供可落地操作方案，助力 iPSC 規模化培養工藝優化。

內容回顧：PBS Mini 中 iPSC 聚集體 3D 培養系列 1（點擊查看）

1. 在接種到 3D 培養之前，先將細胞在 2D 種子培養體系中擴增，或直接將解凍后的細胞轉入 3D 培養。

2. 培養基、試劑及 2D 培養參數應根據您的細胞株和實驗條件進行優化。

3. 在轉入 3D 懸浮培養前，您的 2D 種子培養體系須具備以下特點：特性明確、重復性和穩定性

摘要：本文聚焦細胞治療臨床轉化中 iPSC 規模化 3D 培養的核心瓶頸，基于 PBS Biotech 廠家資料及數百個客戶實際應用經驗，系統拆解了 PBS Mini 垂直輪生物反應器中 iPSC 3D 聚集體培養的接種關鍵技術。文章闡明了單細胞傳代作為 3D 培養黃金標準的必要性，詳細介紹了培養基預平衡、質量檢測、ROCK 抑制劑添加的接種前三步法，以及標準化接種密度、濃縮接種液制備和操作規范，并給出了不同場景的工具使用指南。本文為研究者提供了可復制、可放大的 iPSC 3D 培養接種方案，助力 iPSC 細胞治療工藝的標準化與臨床轉化。

在細胞治療從實驗室走向臨床的關鍵階段，iPSC多能干細胞的規模化、標準化3D培養已成為行業都認為的核心瓶頸。如何獲得大小均一、活力穩定、可重復擴增的細胞聚集體？如何實現從小試到中試的無縫工藝放大？如何降低每批次的生產成本？

作為 PBS 垂直輪生物反應器 的核心技術合作伙伴，曼博生物致力于為中國區生物制藥研究者提供從工藝開發到規模化生產的技術支持方案。基于 PBS Biotech 近期發布的資料及數百個客戶的實際應用經驗，我們繼續為大家拆解 iPSC 3D 培養的關鍵技術點-接種，幫你避開不必要的坑。

一、為什么單細胞傳代是 3D 培養的生命線？

很多研發人員在 iPSC 3D 培養中遇到的一個問題就是：聚集體大小不均、擴增倍數低、批次間差異大。大概率，傳代流程需要優化。

無酶解離試劑、細胞刮等團塊傳代方法存在不可逾越的短板：

• 無法獲得單細胞懸液，細胞計數誤差高達 30%以上

• 聚集體大小隨機分布，分化同步性差

• 無法實現工藝放大，從 T 瓶到反應器的參數轉移幾乎不可能

?單細胞傳代：PBS 體系的基礎標準

圖 1.單細胞傳代示意圖

PBS Biotech 經過全球數十家頭部細胞治療企業驗證，Accutase 酶解單細胞傳代法是 iPSC 3D 培養的可放大方案：

• 標準化酶解條件：推薦酶體積與培養面積比為 0.08 mL/cm2，2D 培養瓶中酶解時間控制在 7-10 分鐘

• 細胞質量控制：酶解后單細胞率盡可能≥88%（即≥5 個細胞的團塊占比≤12%），細胞活力≥90%

圖 2.種子細胞解離，單細胞率統計示例。圖中 NC-200 應用顯示，12%的細胞形成≥5 個細胞的團塊

• 核心優勢：

?細胞計數更準確，工藝可追溯性強

?產生更多更小的初始聚集體

?更容易放大

?產生更均一的聚集體尺寸大小

• 這些因素共同作用，使流程更加順暢且保障效率，細胞潛在擴增倍數更高，并能更好地控制聚集體的形狀和大小。

二、準備 PBS Mini 進行接種

PBS Mini 接種前標準化三步法

1.培養基預平衡（提前 12-24 小時）

• 加入 95%工作體積的無 ROCK 抑制劑的培養基

• 0.1L 容器：95mL；0.5L 容器：475mL

• 置于培養箱中，設置目標攪拌轉速（推薦 40rpm）過夜平衡

• 培養箱參數：37℃，5%CO?，相對濕度≥90%

圖 3.培養基預平衡示意圖

2.培養基質量檢測（接種前必做）

轉移 3-5mL 培養基至生物安全柜，檢測并分析以下關鍵參數：

圖 4.接種前培養基質量檢測與記錄

3.ROCK 抑制劑添加

• 按最終工作濃度 10μM 計算所需 ROCKi 體積

• 與少量新鮮培養基混合后無菌過濾

• 加入反應器中，使總體積恢復至 95%工作體積

圖 5.Rocki 使用推薦操作流程

關鍵提醒：ROCKi 必須在接種前 30 分鐘內加入，過早加入會導致藥效下降，影響單細胞存活。

三、接種：決定聚集體均一性的核心環節

接種密度和接種方法直接決定了后續聚集體的大小和生長狀態，PBS 體系經過優化，形成了一套可復制的標準化接種流程。

1.接種密度參數

PBS Mini 反應器中，iPSC 3D 培養的推薦接種密度為 20,000 活細胞/mL（針對不同工藝需求，通常在 2e4-1e5 間優化），這是經過全球數百個項目驗證的較優值：

• 過低：聚集體形成困難，細胞凋亡增加

• 過高：聚集體過大，中心壞死，分化效率下降

2.濃縮接種液制備

接種密度（Inoculation density）：每毫升培養物中所引入的細胞數量；

接種物（Inoculum）：用于接種至培養體系的濃縮細胞懸液。

圖 6（表格）.接種液體積與體系體積比例示意

• 制備 400,000 活細胞/mL 的濃縮接種液

• 接種體積為總工作體積的 5%

? 0.1L 罐：加入 5mL 接種液

? 0.5L 罐：加入 25mL 接種液

• 計算公式：C?V?=C?V?（務必多制備 10-20%的接種液，以補償移液損失）

3.標準化接種操作

1. 將反應器轉移至生物安全柜

2. 充分混勻接種液（每次接種前都要重新混勻）

3. 使用血清移液管緩慢加入接種液，沖洗移液管一次

4. 立即將反應器放回培養箱，啟動攪拌

圖 7.接種操作示意圖

避坑指南：不要使用微量移液器處理接種液！微量移液器的小口徑會產生較高的剪切力，導致細胞活力下降 15-20%。

四、接種和混合 tips

PBS 垂直輪反應器之所以成為 iPSC 3D 培養的常用體系，核心在于其獨特的低剪切、高均一性混合特性。但要充分發揮這一優勢，建議掌握正確的混合方法。

不同場景的工具選擇指南

圖 8.不同場景的工具選擇

表 2. 不同場景的接種工具選擇

PBS Mini 接種與混合的三大黃金法則

1. 細胞懸液轉移前必須充分溫和混勻

2. 同一實驗的反應器使用同一批接種液

3. 接種后 2 小時內取樣計數，驗證實際接種密度

圖 9.接種示意圖

五、 總結

1. 采用單細胞懸液進行傳代，禁止團塊傳代。

2. 接種細胞前，先向 Mini 反應器罐體中加入培養基并置于培養箱中充分平衡。

3. 檢測新鮮培養基的 pH 值、營養物質及代謝物濃度，用于工藝表征、過程控制及后續放大準備。

4. 制備統一的濃縮細胞接種液，用于同一實驗中反應器的接種，并始終設置 2D 培養對照組。

5. 分裝細胞懸液前，必須充分混勻。

六、寫在后面

iPSC 細胞治療的商業化之路，離不開標準化、規模化的生產工藝。PBS Mini 垂直輪生物反應器憑借其獨特的設計優勢和經過全球驗證的標準化流程，為 iPSC 3D 培養提供了從實驗室到臨床的完整解決方案。

作為 PBS Biotech 在中國的合作伙伴，曼博生物擁有多人技術支持團隊，可為您提供從設備安裝、工藝開發到問題排查的一站式服務。如果您在 iPSC 聚集體培養過程中遇到任何問題，歡迎在評論區留言，或直接聯系我們的技術工程師。此外，曼博生物擁有覆蓋 iPSC 種子細胞制備、3D 培養工藝優化及規模化生產的整體解決方案，更多iPSC細胞培養內容咨詢曼博生物了解詳情！

下期預告：《PBS Mini 中 iPSC 聚集體 3D 培養系列 3：推薦的 3D 培養參數》，敬請關注！

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PBS Mini 中 iPSC 聚集體 3D 培養系列 1：從 2D 到 3D 的無縫銜接｜曼博生物

本文基于PBS Biotech公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實驗參考等。上海曼博生物可提供PBS Mini 垂直輪生物反應器、PBS 垂直輪生物反應器、iPSC 3D 聚集體培養、iPSC 規模化接種、iPSC 種子細胞制備、3D 培養工藝優化及規模化生產相關產品與技術支持，助力誘導多能干細胞（iPSC）3D 培養工藝標準化、臨床轉化與規模化生產應用。

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