批培養/補料/ATF灌流三種工藝方案全驗證

摘要：本文基于PBS Biotech與GeneFab聯合發布的white papers，驗證了PBS垂直輪生物反應器的CAR-NK擴增工藝。經0.1L小試參數優化、3L中試對比三種培養模式，結果顯示灌流工藝可使細胞擴增倍數提升2.6倍，細胞殺傷效力優于靜態培養，且系統線性放大性優異，為CAR-NK臨床級規模化生產提供數據支撐。

關鍵詞：垂直輪生物反應器、PBS Mini、CAR-NK、PBS 3L、ATF灌流工藝、補料批培養、PBS垂直輪生物反應器、CAR-NK高密度擴增、工藝放大、批培養、NK細胞擴增

隨著NK細胞免疫療法在腫瘤、自身免疫病等領域的臨床推進，如何實現穩定、可放大的臨床級細胞擴增，成為行業普遍關注的核心問題。傳統靜態培養體系存在操作繁瑣、污染風險高、批培養一致性差、放大難度大等短板，難以匹配商業化生產需求。

近期，PBS Biotech聯合GeneFab發布專項white papers，以人外周血來源CAR-NK為研究對象，在PBS垂直輪生物反應器（可訪問曼博生物查看）體系內，系統驗證了批培養、補料批培養、ATF灌流三種培養策略的擴增表現，完成了從0.1L小試到3L中試的全流程工藝驗證，為CAR-NK規模化生產提供了實測數據參考。

圖1.PBS Mini垂直輪反應器系列，包括PBS Mini基座（非一次性）和一次性耗材兩部分，其中耗材有0.1L和0.5L兩種耗材規格。

一、研究設計：覆蓋從小試到中試的全流程驗證

該研究中采用經輻照K562滋養層激活、逆轉錄病毒轉導的CAR-NK細胞，分別在PBS-0.1Mini（100mL工作體積）與PBS-3（3L工作體積）垂直輪生物反應器中開展實驗，核心評估維度包括：

• 攪拌轉速、接種密度等關鍵工藝參數優化

• 批培養、補料批培養、灌流三種培養模式的擴增效率對比

• 細胞活率、凋亡水平、CAR表達、殺傷效力等質量屬性評價

• 從小試到中試的工藝放大一致性驗證

圖2.補料批培養培養與灌流培養體系下，NK細胞從活化、擴增至凍存的工藝流程示意圖

二、PBS Mini 0.1L小試：初步鎖定核心工藝參數

PBS Mini 0.1L作為低成本的縮小模型，可快速完成工藝參數篩選，降低中試開發風險。研究針對攪拌轉速、接種密度兩大核心變量開展了系統優化：

1.攪拌轉速：30-50rpm為較優區間

研究測試了10、30、50、100rpm四檔轉速：

• 10rpm：混合效率不足，出現明顯細胞沉降與團聚，擴增受限

• 100rpm：剪切應力提升，細胞凋亡比例增加，影響細胞健康狀態

• 30/50rpm：可支持穩健的細胞擴增，其中30rpm批培養模式下，12天擴增倍數可達36倍，效果優于10rpm組

表1.PBS-0.1中參數評估與擴增結果

2.接種密度：低接種密度實現更高擴增倍數

測試了5×10?、1×10?、2.5×10?、4×10?cells/mL四檔接種密度（補料批培養模式）：

• 5×10?cells/mL：擴增倍數較優，10天可達50倍

• 隨接種密度升高，擴增倍數逐步下降；高接種密度下營養消耗更快，生長平.臺期更早出現

• 綜合總細胞產量與工藝效率，從而選擇1×10?cells/mL作為中試放大的基準接種密度

此外，培養基中添加1g/LPluronicF-68作為剪切保護劑，可進一步降低攪拌過程中的細胞損傷，提升培養體系穩定性。

圖3A-B.30rpm與50rpm攪拌轉速下的細胞擴增倍數，約為10rpm組的2倍。培養12天后，葡萄糖濃度降至約1.5g/L，乳酸濃度升至約1.4g/L。

圖3C-D.100rpm恒速與50→100rpm變速攪拌條件下，終細胞密度相近；而50rpm恒速條件下細胞擴增效果較優。10天培養周期結束時，葡萄糖濃度降至約2g/L，乳酸濃度升至約0.8g/L。細胞生長通常在此代謝水平下進入平.臺期，與細胞密度變化趨勢一致。

圖3E-F.50×103cells/mL的較低接種密度可實現較高的擴增倍數。10天培養結束時，50×103cells/mL與100×103cells/mL接種組的代謝譜特征相近。

三、PBS-3L中試：補料批培養可明顯提升細胞產量

基于小試優化參數，研究將工藝放大至3L規模，并對比了批培養與補料批培養兩種培養策略：

• 批培養模式：3L全體積起始培養，全程不補加培養基

• 補料批培養模式：2L起始培養，接種后第3天補加1L新鮮培養基至滿體積

實驗結果顯示，補料批培養策略通過補充營養、稀釋代謝廢物，有效延緩了生長平.臺期，總細胞產量優于批培養模式；同時0.1L小試與3L中試的細胞生長動力學、代謝趨勢高度一致，驗證了PBS垂直輪反應器的線性放大特性，工藝參數可直接遷移，大幅降低放大風險。

圖4.細胞擴增結果分析圖。該組圖譜包含三部分內容：(A)非灌流培養批培養的細胞密度變化曲線；(B)經FLEX2代謝分析儀檢測的葡萄糖、乳酸濃度變化（實線代表葡萄糖，虛線代表乳酸）；(C)三個培養批培養的細胞計數及擴增倍數統計。結果證實：相較于批培養模式，采用補料批培養換液策略可獲得更高的細胞產量

代謝數據顯示，當葡萄糖濃度降至約2.0g/L、乳酸濃度超過1.0g/L時，細胞生長開始進入平.臺期，這一閾值也為后續灌流工藝的啟動時機提供了參考依據。

四、ATF灌流工藝：擴增產量提升2.6倍

為進一步實現工藝強化，研究在3L反應器上搭配RepligenATF2系統，開發了灌流培養工藝，灌流速率設定為1.5L/天（0.5VVD）。

圖5.灌流培養操作工藝圖譜。(A)4號批培養（R4-DB-灌流）與5號批培養（R5-DB-灌流）的細胞密度變化曲線，圖中標注各階段灌流啟動節點；(B)葡萄糖與乳酸代謝濃度變化曲線（實線代表葡萄糖，虛線代表乳酸）；(C)細胞收獲總量、細胞擴增倍數對比；其中4號批培養接種密度為250cells/μL，5號批培養接種密度為300cells/μL；(D)灌流運行計劃表（VVD：每日罐體工作體積換液量）。

1.擴增效率大幅提升

相較于同供體的補料批培養工藝，灌流模式下細胞擴增倍數提升2.6倍，較高活細胞密度達5×10?cells/mL，3L體系單批培養總活細胞量可達1.5×10?。

2.細胞質量無明顯影響

通過凋亡檢測驗證，灌流啟動前后細胞健康狀態無明顯差異，健康細胞占比穩定在60%以上，說明垂直輪溫和的流體環境+ATF低剪切截留模式，不會對NK細胞造成額外損傷。

圖6.5號灌流培養批次（R5-DB-Perfusion）細胞健康狀態評估。對灌流啟動前后的細胞健康狀態進行檢測對比，結果表明灌流啟動前后細胞整體健康水平基本一致。

3.代謝環境更穩定

灌流可持續補充新鮮營養并移除乳酸等代謝廢物，使培養體系的葡萄糖、乳酸濃度維持在穩定區間，避免了批培養培養中代謝廢物積累導致的生長抑制。

研究同時指出，以細胞密度/代謝水平作為灌流啟動依據，比固定天數啟動更具經濟性，可提升培養基利用效率。

五、功能驗證：反應器擴增細胞殺傷效力更優

細胞擴增數量之外，功能活性是臨床價值的核心。研究通過LDH殺傷實驗，對比了PBS反應器與靜態G-Rex培養體系擴增的CAR-NK細胞效力：

• 培養第7天：PBS組相對殺傷效力為G-Rex組的1.77倍

• 培養第8天：PBS組相對殺傷效力提升至G-Rex組的2.56倍

結果表明，垂直輪反應器的動態培養環境，不僅能提升細胞產量，還有助于維持甚至增強CAR-NK細胞的腫瘤殺傷功能。此外，擴增后的細胞CAR表達水平正常，經凍存復蘇后活性符合要求，適配臨床制備的全流程需求。

圖7.靜態G-Rex培養體系與5號灌流培養批次（R5-DB-Perfusion）的細胞相對效力（RP）對比。(A)接種后第7天，PBS-3反應器與G-Rex培養體系的細胞相對效力；(B)接種后第8天，PBS-3反應器與G-Rex培養體系的細胞相對效力。

圖8.單一供體（供體B）來源CAR-NK細胞在垂直輪生物反應器（VWB）中的細胞密度變化。(A)PBS-3與PBS-0.1反應器的補料批培養結果顯示，二者生長動力學特征一致，驗證了工藝線性放大的一致性；(B)PBS-3反應器中補料批培養與灌流培養的對比表明，采用灌流換液策略可有效提升細胞產量。

六、總結與展望

本次研究系統驗證了PBS垂直輪生物反應器在CAR-NK擴增中的可行性與優勢：

1. 低剪切環境適配免疫細胞：溫和的流體特性可維持高細胞活率與功能活性

2. 線性放大降低開發成本：使用0.1LMini模型的工藝參數可直接遷移至3L及更大規模

3. 灌流工藝強化產能：搭配ATF灌流后，細胞產量較補料批培養提升2.6倍

4. 滿足臨床級生產需求：按實驗數據推算，80L規模灌流培養下，理論總細胞產量可達4×1011，可滿足多位患者的臨床治療劑量需求（參考文獻中NK細胞療法的治療劑量通常為每公斤體重5×10?~1×10?個NK細胞）。

同時該white papers也客觀指出，目前的工藝尚未達到體系上限，通過進一步優化培養參數、采用基于實時代謝的反饋式灌流策略，細胞密度與產量還有進一步提升的空間。

整體而言，這套“垂直輪反應器+ATF灌流"的CAR-NK擴增工藝，為細胞治療企業提供了一套可復制、可放大、合規性強的規模化生產解決方案。

擴展閱讀

PBS垂直輪生物反應器技術專欄（可訪問曼博生物查看）

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本文基于PBS Biotech與GeneFab聯合發布的專項white papers資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實驗參考等。上海曼博生物可提供PBS Biotech PBS Mini、PBS-3等垂直輪生物反應器、0.1L與0.5L一次性耗材及CAR-NK臨床級規模化擴增相關產品與技術支持。

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