關(guān)鍵詞：貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染、懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染、PEI轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、293T細(xì)胞、Expi293F、CHO-S、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)、抗體生產(chǎn)

摘要：本文結(jié)合293T、Expi293F、CHO-S三類細(xì)胞的生長(zhǎng)與表達(dá)特性，分別制定貼壁、懸浮體系的PEI瞬轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，明確接種密度、復(fù)合物制備等核心參數(shù)；同時(shí)從溫度調(diào)整、分批補(bǔ)料、收獲窗口期三方面給出轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)優(yōu)化方案，匯總轉(zhuǎn)染效率偏低、細(xì)胞大量死亡、表達(dá)量不足、放大產(chǎn)量下降四類常見(jiàn)問(wèn)題的解決路徑，為重組蛋白與抗體的小試到中規(guī)模制備提供全流程參考。

三類主流表達(dá)細(xì)胞系的PEI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與蛋白產(chǎn)量提升方案

本文針對(duì)293T、Expi293F、CHO-S三類主流表達(dá)細(xì)胞系，提供 PEI轉(zhuǎn)染試劑 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，梳理轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件優(yōu)化與收獲時(shí)機(jī)選擇方案，匯總常見(jiàn)問(wèn)題的排查思路與解決方法，為重組蛋白與抗體表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)操參考。

一、三類宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染特性與適配方向

不同細(xì)胞系在生長(zhǎng)特性、核酸攝取能力、蛋白表達(dá)能力上存在差異，對(duì)應(yīng)的PEI轉(zhuǎn)染方案需針對(duì)性調(diào)整：

• HEK293T為貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染耐受度高、表達(dá)速度快，適合小規(guī)模蛋白快速表達(dá)與功能驗(yàn)證；

• Expi293F為懸浮馴化的293細(xì)胞，細(xì)胞密度高、表達(dá)量大，適合中大規(guī)模重組蛋白與抗體的瞬轉(zhuǎn)生產(chǎn)；

• CHO-S為懸浮中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，蛋白翻譯后修飾更接近天然抗體，是抗體藥物表達(dá)的常用宿主，但其轉(zhuǎn)染難度略高于293系列細(xì)胞，需更精細(xì)的參數(shù)優(yōu)化。

二、分細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染操作流程

1. HEK293T貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程（6孔板規(guī)模）

1. 該流程適用于重組蛋白、抗體的小規(guī)模快速表達(dá)驗(yàn)證。

2. 轉(zhuǎn)染前1天接種：按每孔2×10?細(xì)胞的密度接種至6孔板，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天準(zhǔn)備：確認(rèn)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%，更換為低血清培養(yǎng)基（血清占比＜5%），每孔培養(yǎng)基總體積2mL；

4. 復(fù)合物制備：取1μg質(zhì)粒DNA用100μLOpti-MEM稀釋混勻；另取對(duì)應(yīng)比例的PEI工作液用100μLOpti-MEM稀釋混勻；將PEI稀釋液緩慢加入DNA稀釋液中，輕柔混勻后室溫孵育15分鐘；

5. 加樣培養(yǎng)：將復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使其均勻分布，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

6. 轉(zhuǎn)染后處理：轉(zhuǎn)染后18-24小時(shí)更換為培養(yǎng)基；若細(xì)胞對(duì)低血清耐受度好，也可選擇不換液。

圖1.貼壁細(xì)胞HEK293 PEI轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)流程

2.Expi293F懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程（500mL搖瓶規(guī)模）

適用于重組蛋白、抗體的中規(guī)模制備。

1. 轉(zhuǎn)染前1天接種：按0.8×10? cells/mL的密度接種細(xì)胞，置于37℃、120rpm、5%CO?搖床中培養(yǎng)；

2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天確認(rèn)狀態(tài)：細(xì)胞密度達(dá)到1.8-2.2×10?cells/mL，細(xì)胞活力不低于98%；

3. 復(fù)合物制備：取150μg質(zhì)粒DNA（抗體表達(dá)常用重鏈：輕鏈=1:1）用5mLOpti-MEM稀釋；取對(duì)應(yīng)量PEIMAX用5mLOpti-MEM稀釋；將PEI稀釋液滴加入DNA稀釋液，混勻后室溫孵育15分鐘；

4. 加樣與補(bǔ)料：將復(fù)合物加入搖瓶中，輕輕混勻后放回?fù)u床；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，補(bǔ)加10%-20%體積的新鮮表達(dá)培養(yǎng)基與對(duì)應(yīng)補(bǔ)料。

3.CHO-S懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程（500mL搖瓶規(guī)模）

適用于抗體分子的表達(dá)制備。

1. 轉(zhuǎn)染前1天接種：按1.0×10?cells/mL的密度接種細(xì)胞，37℃、120rpm、5%CO?搖床培養(yǎng)；

2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天確認(rèn)狀態(tài)：細(xì)胞密度達(dá)到2.5-3.0×10? cells/mL，活力不低于95%；

3. 復(fù)合物制備：取200μg質(zhì)粒DNA（抗體表達(dá)常用重鏈：輕鏈=2:3）用5mLOpti-MEM稀釋；取對(duì)應(yīng)量PEIMAX用5mLOpti-MEM稀釋；同上述方法制備復(fù)合物；

4. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)：復(fù)合物加入搖瓶混勻后繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將培養(yǎng)溫度降至31℃，同時(shí)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基與對(duì)應(yīng)添加劑；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行第二次補(bǔ)料。

圖2.懸浮細(xì)胞PEI轉(zhuǎn)染流程

三、轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)優(yōu)化與收獲時(shí)機(jī)選擇

轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)條件直接影響蛋白積累量與活性，需從溫度、補(bǔ)料、收獲時(shí)間三個(gè)維度優(yōu)化。

1.溫度控制

常規(guī)培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?、飽和濕度。對(duì)于CHO-S細(xì)胞的抗體表達(dá)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)降溫至31℃培養(yǎng)，可降低細(xì)胞代謝速率，延長(zhǎng)存活周期，提升抗體整體產(chǎn)量。

2.補(bǔ)料與換液

• 貼壁293T細(xì)胞可通過(guò)換液更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)，耐受度好的細(xì)胞也可維持原培養(yǎng)體系；

• 懸浮細(xì)胞體系通常采用補(bǔ)料策略，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)分批次補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基或?qū)Ｓ醚a(bǔ)料，維持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給，延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間。

3.收獲時(shí)間選擇

不同細(xì)胞系的蛋白表達(dá)峰值時(shí)間不同，需結(jié)合蛋白類型選擇收獲時(shí)機(jī)：

• 293T細(xì)胞：胞內(nèi)蛋白通常48-72小時(shí)達(dá)峰，分泌型蛋白與抗體72-96小時(shí)達(dá)峰；

• Expi293F細(xì)胞：胞內(nèi)蛋白72-96小時(shí)達(dá)峰，分泌蛋白與抗體96-120小時(shí)達(dá)峰；

• CHO-S細(xì)胞：整體表達(dá)周期更長(zhǎng)，抗體通常在120-168小時(shí)達(dá)到峰值。

收獲過(guò)早蛋白積累不足，收獲過(guò)晚則易被細(xì)胞分泌的蛋白酶降解。建議設(shè)置時(shí)間梯度，確定目標(biāo)蛋白的合適收獲時(shí)間。

四、常見(jiàn)轉(zhuǎn)染問(wèn)題的排查與解決

1.轉(zhuǎn)染效率偏低

常見(jiàn)原因包括細(xì)胞狀態(tài)差、質(zhì)粒質(zhì)量不合格、N/P比例不合適、復(fù)合物制備操作有誤、稀釋液成分不適配。

對(duì)應(yīng)解決方向：更換低代次、高活力細(xì)胞；重新提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒；優(yōu)化DNA與PEI的配比；嚴(yán)格執(zhí)行PEI加入DNA的操作順序；更換為Opti-MEM等合規(guī)稀釋液。

2.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞大量死亡

通常由DNA/PEI用量過(guò)高、復(fù)合物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、轉(zhuǎn)染后未及時(shí)換液導(dǎo)致。

可通過(guò)降低核酸或PEI用量、縮短復(fù)合物孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基等方式改善。

3.轉(zhuǎn)染效率達(dá)標(biāo)但蛋白表達(dá)量低

可能原因包括表達(dá)載體元件不合適、收獲時(shí)間過(guò)早、培養(yǎng)條件不佳、蛋白發(fā)生降解。

可優(yōu)化啟動(dòng)子、信號(hào)肽等載體元件；延后收獲時(shí)間匹配表達(dá)峰值；調(diào)整溫度與補(bǔ)料策略；必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加蛋白酶抑制劑。

4.小試效果穩(wěn)定，放大后產(chǎn)量下降

多由混合均勻度不足、搖瓶參數(shù)不匹配、細(xì)胞密度控制偏差導(dǎo)致。

放大生產(chǎn)時(shí)可采用磁力攪拌緩慢混勻復(fù)合物；優(yōu)化搖瓶轉(zhuǎn)速與裝液量；保持與小試一致的轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度，降低規(guī)模效應(yīng)帶來(lái)的波動(dòng)。

綜上，PEI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是重組蛋白、抗體及病毒載體研發(fā)中核心的核酸遞送手段，其效率與穩(wěn)定性由細(xì)胞狀態(tài)、核酸品質(zhì)、參數(shù)配比與操作細(xì)節(jié)共同決定。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化需從底層邏輯出發(fā)：細(xì)胞層面嚴(yán)格把控傳代次數(shù)、生長(zhǎng)階段與活力水平，建立規(guī)范的種子庫(kù)與污染防控機(jī)制；核酸層面保障質(zhì)粒純度與低內(nèi)毒素水平，匹配合適用量與比例；通過(guò)梯度優(yōu)化確定適配的N/P配比，同時(shí)規(guī)范復(fù)合物制備的稀釋體系、加樣順序與孵育時(shí)長(zhǎng)。唯有系統(tǒng)化控制變量、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，才能構(gòu)建穩(wěn)定可重復(fù)的轉(zhuǎn)染體系，為生物制藥與基礎(chǔ)科研的體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)提供可靠支撐。

目前市售 PEI轉(zhuǎn)染試劑 覆蓋不同分子量與劑型，其中Polysciences旗下的25 kDa線性PEI、40kDa PEI MAX等產(chǎn)品，適配上述三類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染需求。

本文基于Polysciences公開(kāi)資料由其中國(guó)提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實(shí)驗(yàn)參考等，具體參數(shù)需結(jié)合實(shí)驗(yàn)體系與蛋白特性進(jìn)一步優(yōu)化。上海曼博生物可提供Polysciences 25 kDa線性PEI、40kDa PEI MAX及293T、Expi293F、CHO-S細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相關(guān)PEI轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品。

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