無細胞蛋白表達系統實現復雜轉錄因子

*注：下文出于保密考慮，已隱去蛋白名稱及具體文獻引用。

一、引言

轉錄因子（TFs）是調控多種細胞通路的關鍵蛋白，常被稱為 “主控調節因子"。其中，轉錄因子 L（TF L）在神經分化、造血及器官發生等發育過程中作用關鍵，對維持干細胞多能性和中樞神經系統、眼部等組織的正常發育十分重要，其失調與相關難治性發育障礙密切相關，是潛在治療靶點。

然而，TF L的表達與純化（尤其全長形式或特定功能結構域）因蛋白結構復雜具有挑戰性：其含LIM結構域、同源結構域及內在無序區域，在大腸桿菌中表達易錯誤折疊形成包涵體，復性條件難優化且功能蛋白得率低；昆蟲細胞（Sf9）、哺乳動物細胞（HEK293、CHO）、酵母（畢赤酵母）等其他系統也存在得率不足、純化復雜、蛋白降解等問題。這些難題嚴重限制了TF L的結構與功能研究，阻礙了靶向療法研發。

本應用我們采用eProtein Discovery系統成功表達并純化了全長TF L，以及一個未知功能結構域（L2）及其結合結構域（L3）。通過使用可溶性標簽，以及富含鋅離子（Zn2?）和二硫鍵形成劑的無細胞混合體系，我們優化了可溶性TF L蛋白的制備流程。利用標記488 Atto染料、含TF L結合位點的雙鏈DNA，對純化后蛋白的 DNA 結合功能進行了驗證。研究結果不僅解決了TF L合成領域長期存在的技術難題，更為治療性藥物研發開辟了新路徑，同時確立了eProtein Discovery系統作為復雜轉錄因子研究與制備領域變革性工具的核心地位。

二、無細胞蛋白表達系統工作流程

eProtein Discovery系統利用數字微流控技術，可自動篩選多種DNA 構建體（eGene構建體）和無細胞混合體系，優化可溶性目標蛋白的制備與純化條件（圖 1）。系統能在24小時內生成192組表達數據和30組純化數據，這一快速篩選能力加速了蛋白放大生產條件的確定。僅需48小時，用戶即可完成從DNA到可溶性、經純化且可直接用于實驗的蛋白制備，較大程度簡化了生產流程，推動科研與治療性蛋白研發的快速推進。

圖1：eProtein Discovery系統流程圖：48小時內完成從DNA到可直接用于實驗的蛋白制備。

三、方法

1、eProtein Discovery系統篩選

本研究利用eProtein Discovery系統開展結構預測、實驗運行、數據可視化及分析工作。樣品制備采用可溶性標簽篩選技術，將eGene構建體加載至eProtein Discovery篩選卡盒中完成。本研究選取了三種TF L變體（圖 2）：全長蛋白、未知功能結構域（L2）及 DNA 結合結構域（L3）。將這些變體導入eProtein Discovery云軟件進行密碼子優化后，在其兩端添加3C和TEV序列。L2和L3變體的設計借助系統內置的 AlphaFold 結構預測工具，通過精準識別并分離TF L的重要功能區域完成。使用eGene制備試劑盒（可溶性標簽篩選）構建含不同可溶性標簽的表達載體，同時構建1個無可溶性標簽的對照載體，最終獲得24個 eGene構建體（圖 3a）。每個構建體的C端均含鏈霉親和標簽（Strep-tag）（用于磁珠純化）和檢測標簽（用于蛋白表達及純化后的定量分析）。

圖2：TF L變體的AlphaFold結構預測。圖示為全長TF L的預測結構（重點關注區域已高亮標注）。蛋白變體L2和L3基于上述區域篩選設計，同時獲得了這些截短蛋白的結構預測結果。

圖3：eGene構建體與無細胞混合體系的篩選。(A) 含可溶性標簽的TF L eGene構建體設計方案。(B) 用于提高可溶性蛋白得率的無細胞混合體系篩選結果。

本研究選取8種無細胞混合體系，其包含無細胞核心蛋白翻譯機制，并添加了金屬輔因子、分子伴侶（DnaK）、二硫鍵促進劑（PDI+/GSSG）及用于可溶性標簽切除的 3C 蛋白酶（圖 3b）。鑒于TF L含兩個 LIM 結構域，特選用Zn2?，推測其可穩定TF L中這些富含cysteine的鋅結合區域。

將24個eGene構建體、8種無細胞混合體系，連同純化磁珠、對照樣品、空白樣品及洗脫緩沖液一同加載至卡盒中。借助eProtein Discovery系統的自動化功能，該實驗設置可生成并分析192組表達圖譜。系統自動篩選出每種TF L變體對應的10組高表達eGene/無細胞混合體系組合用于純化，并通過蛋白檢測確定預測放大生產得率，上述所有流程均在24小時內完成。

2、放大生產蛋白質

針對每種TF L變體，選取預測純化得率最高的無細胞表達組合進行過夜放大培養，采用放大生產專用試劑純化，最終獲得微克級目標蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot實驗，驗證了蛋白的成功表達與純化。

3、DNA 結合實驗

通過DNA結合電泳遷移率變動分析（EMSA）評估蛋白的 DNA 結合能力并驗證其正確折疊。將放大生產獲得的TF L變體與Atto 488標記的雙鏈DNA（dsDNA）共同孵育（該dsDNA通過退火含TF L結合位點的單鏈 DNA（ssDNA）制備）。樣品在4–16%天然凝膠中電泳，通過與游離DNA探針對比評估遷移率變動。采用含突變TF L結合位點的陰性對照驗證結合特異性。針對全長TF L，設置三個濃度梯度以探究蛋白濃度對DNA-TF L復合物形成的影響。

四、數據與討論

eProtein Discovery系統在轉錄因子L（TF L）的全長蛋白、未知功能結構域（L2）及結合結構域（L3）的表達與純化中展現出出色效率。該技術24小時內快速篩選192組表達條件，生成30組可純化性數據。通過全面篩選，成功確定了可溶性功能性TF L變體的制備條件。如圖 4 所示，已明確獲得更高表達及純化效果的可溶性標簽與無細胞混合體系組合，凸顯了該系統通過精準優化條件以實現更高得率和純度的核心能力。

在篩選出的Top30表達條件中，所有構建體均含可溶性標簽，凸顯其在獲得可溶性及可純化蛋白得率中的關鍵作用。全長TF L和L2采用P17可溶性標簽，L3采用CUSF標簽，與無可溶性標簽的構建體相比，蛋白表達量提升1.83倍。這一結果表明，該技術可通過策略性標簽篩選優化表達效率，對需表達復雜難制備蛋白的研究人員而言是核心優勢。

此外，無細胞混合體系的使用進一步提高了表達得率。每個體系均含Zn2?，其對穩定TF L中富含cysteine的鋅結合區域十分重要。添加GSSG使全長TF L的蛋白表達量提升約11%，而蛋白二硫鍵異構酶（PDI?）與 GSSG 的組合使L2和L3的表達量分別顯著提升75%和47%（緩沖液 + Zn2?組數據未展示）。GSSG和PDI?/GSSG提供的氧化環境可維持cysteine殘基的氧化還原狀態，進而支持蛋白正確折疊，這對TF L的結構完整性十分重要。盡管TF L本身不含二硫鍵，但維持適宜的氧化還原環境可避免異常相互作用（如cysteine錯配或蛋白聚集），確保LIM結構域中鋅離子的正確配位。

圖4：TF L變體的表達與純化結果。

將優化后的構建體和無細胞混合體系混合進行過夜放大培養，在1.5 mL離心管中獲得微克級的各TF L變體蛋白。SDS-PAGE分析證實蛋白成功表達并純化，考馬斯亮藍染色凝膠顯示，洗脫泳道中出現與預期分子量一致的單一蛋白條帶，表明純化后蛋白純度達標（圖5）。通過抗Strep-tag II抗體驗證了L2和L3變體C端鏈霉親和標簽（Strep-tag）的存在，證實完整蛋白序列已成功合成（圖5）。

圖5：放大生產結果。

為驗證合成蛋白的功能，開展了DNA結合EMSA實驗。結果證實，eProtein Discovery系統制備的蛋白保留了天然功能：全長TF L與含其結合位點的Atto 488標記 DNA 探針呈濃度依賴性結合，天然凝膠上可見清晰遷移率變動（圖6A）；L3結合結構域也成功與DNA探針形成復合物，而陰性對照（含突變TF L結合位點的 DNA）無結合現象，證實了相互作用的特異性（圖6B）。值得注意的是，L2結構域未與DNA結合，提示其在TF L中可能承擔其他結構或功能角色，這對TF L的調控活性可能十分重要。

圖6：DNA結合EMSA實驗結果。(A) 不同濃度的全長TF L與含TF L結合位點的Atto 488標記雙鏈DNA（dsDNA）孵育后，經天然凝膠分析的結果；采用含突變TF L結合位點的陰性對照探針驗證結合特異性。(B) TF L未知功能結構域（L2）及結合結構域（L3）的 DNA 結合能力評估結果。

五、結論

eProtein Discovery 系統是攻克轉錄因子 L（TF L）表達與純化難題的突破性工具，該蛋白對發育生物學和治療創新十分重要。相較于傳統方法易導致蛋白錯折疊、得率低的問題，該系統借助數字微流控技術，能快速優化表達條件，48小時內即可提效制備高質量功能性蛋白，且經DNA結合實驗證實其關鍵生物學功能得以保留。該系統為藥物研發、再生醫學及復雜蛋白研究提供了核心支撐，助力加速科研突破。

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