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Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)：克服抑制/增強(qiáng)干擾的操作程序

閱讀：278 發(fā)布時(shí)間：2025-8-18

背景

革蘭氏陰性菌（GNB）給全球公共衛(wèi)生造成了最嚴(yán)重的問題之一，因?yàn)檫@種細(xì)菌對(duì)抗生素有高度耐藥性¹，而且會(huì)引發(fā)肺炎、血液感染、傷口和手術(shù)部位感染、腦膜炎等感染性疾病²。細(xì)菌內(nèi)毒素是GNB細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分，當(dāng)濃度足夠高時(shí)會(huì)引發(fā)致熱反應(yīng)（即高燒）。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求制藥廠進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET，Bacterial Endotoxins Testing），重點(diǎn)測(cè)量注射用水（WFI，Water For Injection）、制藥原材料、成品藥、醫(yī)療器械等所有涉及注射用藥物的GNB污染程度。細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法主要有以下3種：1、凝膠法（Gel-Clot），2、動(dòng)態(tài)濁度法（KTA，Kinetic Turbidimetric Assay），3、動(dòng)態(tài)顯色法（KCA，Kinetic Chromogenic Assay）。

鱟試劑（LAL，Limulus Amebocyte Lysate）提取自鱟的血液，用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)到內(nèi)毒素時(shí)，鱟試劑級(jí)聯(lián)就會(huì)有一系列酶促反應(yīng)，酶促反應(yīng)會(huì)放大內(nèi)毒素的顯現(xiàn)。當(dāng)內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)時(shí)，內(nèi)毒素會(huì)激活酶級(jí)聯(lián)中的第一個(gè)因子 — C因子，然后C因子會(huì)激活B因子。B因子會(huì)作用于凝固酶原，使其成為凝固酶。最后的檢測(cè)步驟就是凝固（用凝膠法）、濁度（用動(dòng)態(tài)濁度法）或顯色（用動(dòng)態(tài)顯色法）。下圖1是采用動(dòng)態(tài)顯色法時(shí)鱟試劑級(jí)聯(lián)反應(yīng)的示意圖。

圖 1：采用動(dòng)態(tài)顯色法的鱟試劑級(jí)聯(lián)反應(yīng)

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)：克服抑制/增強(qiáng)干擾的操作程序

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

Sievers^®Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀（以下稱Eclipse）采用動(dòng)態(tài)顯色法，用405 nm波長(zhǎng)（即動(dòng)態(tài)顯色法的典型波長(zhǎng)）來測(cè)量和分析內(nèi)毒素的濃度。動(dòng)態(tài)顯色法使用帶有顯色基底的鱟試劑。顯色基底是一種連接對(duì)硝基苯胺（pNA，一種黃色顯色劑）的肽。如果樣品中存在內(nèi)毒素，鱟試劑中的酶促反應(yīng)就會(huì)破壞連接pNA的肽鍵，從而在樣品或溶液中釋放黃色?？梢杂梅止夤舛扔?jì)來測(cè)量顏色變化，量化色變后可以得出內(nèi)毒素濃度。Eclipse還可以使用Fujifilm Wako濁度試劑，也是用405nm波長(zhǎng)來測(cè)量?jī)?nèi)毒素濃度。

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀

Eclipse檢測(cè)儀由以下3部分組成：儀器、獨(dú)特的微流控微孔板、軟件。儀器是一臺(tái)吸光度分析儀，具有37°C恒溫培養(yǎng)控制和離心技術(shù)。微孔板內(nèi)預(yù)置了細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE，Reference Standard Endotoxin）和陽性產(chǎn)品對(duì)照（PPC，Positive Product Controls），允許用戶在每次化驗(yàn)時(shí)運(yùn)行最多5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為50 - 0.005 EU/mL），以及最多21個(gè)樣品及陰性和陽性對(duì)照。Eclipse軟件操作簡(jiǎn)便，符合《聯(lián)邦法規(guī)21章》第11款（21 CFR Part 11）的規(guī)定。

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀，最多減少90%的鱟試劑用量，也可使用重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）

目的和范圍

鱟試劑（LAL）化驗(yàn)易受干擾。樣品中可能含有抑制或增強(qiáng)內(nèi)毒素檢測(cè)的物質(zhì)，因此產(chǎn)生假性結(jié)果。需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行方法適用性測(cè)試和抑制/增強(qiáng)測(cè)試，以確定克服上述干擾所需的稀釋倍數(shù)（或其它有效方法）。

本文概述了如何進(jìn)行抑制/增強(qiáng)測(cè)試，如何運(yùn)行此測(cè)試來證明Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀的適用性，以及提供運(yùn)行樣品的方法適用性。方法信息包括：所用的鱟試劑化驗(yàn)方法、化驗(yàn)靈敏度（λ）、驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)、PPC（陽性產(chǎn)品對(duì)照）加標(biāo)濃度、稀釋劑、%CV（變異系數(shù)）標(biāo)準(zhǔn)、以及平均PPC回收率。

樣品信息包括：樣品濃度（單位為mg/mL）、內(nèi)毒素限值（EL，Endotoxin Limit；單位為 EU/mL）、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD，Maximum Valid Dilution）、最小有效濃度（MVC，Minimum Valid Concentration）、平均樣品結(jié)果（單位為EU/mL）、以及樣品儲(chǔ)存/處理?xiàng)l件。

需要使用的物品和材料

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀，包括分析儀、微孔板、軟件
鱟試劑（LAL）
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（LRW，LAL Reagent Water）
用于干擾測(cè)試的材料（如果需要）：

稀釋用水（LRW），或生理鹽水，或其它種稀釋用液體
葡聚糖封閉緩沖液
加熱塊
緩沖液或pH調(diào)節(jié)試劑：Tris緩沖液、含鎂緩沖液、HCl、NaOH
螯合劑：乙二胺四乙酸（EDTA），用于消除某些金屬干擾
超濾裝置
表面活性劑、非離子去垢劑或三乙胺

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，Control Standard Endotoxin）或細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE，Reference Standard Endotoxin）
不含內(nèi)毒素的稀釋管
不含內(nèi)毒素的移液器吸頭
可調(diào)量程移液器，可進(jìn)行55 μL和1000 μL分液
血清移液器
不含內(nèi)毒素的血清玻璃移液器
渦旋混合器

操作程序

抑制/增強(qiáng)研究：

應(yīng)先進(jìn)行初步的抑制/增強(qiáng)研究，以確定最佳稀釋倍數(shù)，并評(píng)估可能存在的干擾。

根據(jù)待測(cè)樣品總數(shù)、當(dāng)前驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)、以及最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）/最小有效濃度（MVC），選擇不同的稀釋倍數(shù)。

所選稀釋倍數(shù)應(yīng)覆蓋當(dāng)前驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)之上和之下。

例如，如果當(dāng)前驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)為1:500，則所選的稀釋倍數(shù)應(yīng)從1:1（未稀釋）到1:2000，在此范圍內(nèi)評(píng)估實(shí)際最佳稀釋倍數(shù)。如果樣品沒有當(dāng)前驗(yàn)證的稀釋倍數(shù)，則應(yīng)從10倍稀釋倍數(shù)開始選擇，例如選擇1:10、1:100、1:1000等。

所選的稀釋倍數(shù)不可超過最大有效稀釋倍數(shù)。但如果出于研究目的，所選的稀釋倍數(shù)可以超過最大有效稀釋倍數(shù)。

觀察所有樣品的PPC回收率和CV值，以確定適用于當(dāng)前方法的最佳稀釋倍數(shù)。PPC回收率必須在50 - 200%之間才能得到有效結(jié)果。

觀察PPC回收率接近100%且不再隨進(jìn)一步稀釋而提高時(shí)的稀釋倍數(shù)，從而得出克服干擾所需的最佳稀釋倍數(shù)。請(qǐng)注意，由于不同樣品的干擾程度不同，因此無法使每個(gè)樣品的加標(biāo)回收率都達(dá)到100%
CV值應(yīng)低于指定限值。如果沒有指定限值，則CV值應(yīng)低于10%。

如果稀釋后始終無法實(shí)現(xiàn)最佳的PPC回收率，請(qǐng)?jiān)u估是否存在干擾。

如果PPC回收率保持在50%以下，表示結(jié)果被抑制。
如果PPC回收率保持在200%以上，表示結(jié)果被增強(qiáng)。

如有需要，可以在最佳稀釋倍數(shù)附近多選擇幾個(gè)稀釋倍數(shù)來做進(jìn)一步分析。

考慮所有因素之后，請(qǐng)進(jìn)行以下部分的操作：

如果懷疑存在干擾，請(qǐng)進(jìn)行下面的部分B“克服干擾"。
如果不存在干擾，請(qǐng)進(jìn)行后面的部分C“加標(biāo)測(cè)試"。

克服干擾：

干擾測(cè)試的要求根據(jù)樣品性質(zhì)而有所不同。鱟試劑化驗(yàn)要求有最佳和特定的活性條件，例如最佳的溫度、pH值、離子強(qiáng)度。大多數(shù)藥品配方適用于患者診治，而非鱟試劑化驗(yàn)。因此大多數(shù)藥品并不符合鱟試劑化驗(yàn)的最佳條件，會(huì)對(duì)鱟試劑化驗(yàn)有干擾。干擾表現(xiàn)為以下兩種方式之一：抑制或增強(qiáng)。制藥廠應(yīng)當(dāng)非常了解樣品的化學(xué)組成，以便能夠確定干擾源，這非常重要。可以參考“美國(guó)藥典<1085>內(nèi)毒素檢測(cè)指南（USP <1085> Guidelines on Endotoxins Test）"，以了解常見的干擾及其緩解方法。下表是有關(guān)干擾摘要。

表 1. 常見干擾和緩解方法（摘自USP <1085>）

LPS：Lipopolysaccharide，脂多糖

BET：Bacterial Endotoxins Testing，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)

在初始的抑制/增強(qiáng)研究中，如果PPC回收率持續(xù)偏低，且無法通過稀釋來解決問題，請(qǐng)?jiān)u估以下抑制因素來尋找緩解干擾的方法。

如果懷疑存在抑制干擾，干擾源可能是pH值、二價(jià)陽離子、螯合劑、蛋白質(zhì)、塑料提取物、脂類/脂質(zhì)體、重金屬、滲透壓、去垢劑、或鈣離子。

應(yīng)使用一份樣品和一份鱟試劑來測(cè)量樣品的pH值，這是因?yàn)轺c試劑通常有一定的緩沖力?？梢酝ㄟ^稀釋來調(diào)節(jié)pH值，包括直接用HCl或NaOH來調(diào)節(jié)樣品，或者用Tris緩沖液作為稀釋劑來調(diào)節(jié)樣品。
1. pH值范圍由鱟試劑生產(chǎn)商標(biāo)定（通常為6-8）。
可以通過稀釋或超濾來緩解二價(jià)陽離子的干擾。
通常可以通過稀釋來緩解抑制螯合劑的干擾，也可以添加二價(jià)陽離子（例如MgCl₂）來緩解螯合劑的干擾。
可以通過稀釋或熱處理來緩解抑制性蛋白質(zhì)的干擾。
可以添加三乙胺（TEA，0.05%）來緩解塑料提取物的干擾。
可以通過稀釋、添加表面活性劑或非離子去垢劑來緩解脂類或溶酶體的干擾。還需從稀釋用水（LRW）中提出脂類。
可以用水或含有1 mM EDTA的稀釋劑進(jìn)行稀釋，以緩解重金屬的干擾。
通常可以通過稀釋來緩解滲透壓的干擾。
通?？梢酝ㄟ^稀釋來緩解去垢劑的干擾。
可以用水或含有1 mM EDTA的稀釋劑進(jìn)行稀釋，以緩解鈣離子的干擾。

在初始的抑制/增強(qiáng)研究中，如果PPC回收率持續(xù)偏高，且無法通過稀釋來解決問題，請(qǐng)?jiān)u估以下增強(qiáng)因素來尋找緩解干擾的方法。

如果懷疑存在增強(qiáng)干擾，干擾源可能是螯合劑、蛋白質(zhì)、醇/酚、β-葡聚糖、或其它絲氨酸蛋白酶。

通常可以通過稀釋來緩解增強(qiáng)性螯合劑的干擾。
可以通過稀釋或熱處理來緩解增強(qiáng)性蛋白質(zhì)的干擾。
通?？梢酝ㄟ^稀釋來緩解變性劑（如醇和酚）的干擾，也可以通過蒸發(fā)來緩解變性劑的干擾。
可以用葡聚糖封閉緩沖液來重構(gòu)鱟試劑，以緩解β-葡聚糖的干擾。建議使用同一廠家生產(chǎn)的鱟試劑和β-葡聚糖封閉緩沖液。請(qǐng)按照鱟試劑和緩沖液隨附的操作說明進(jìn)行操作。可以通過稀釋或熱處理來緩解其它絲氨酸蛋白酶的干擾。

從初始干擾/增強(qiáng)研究的結(jié)果中，選擇最佳的稀釋倍數(shù)用于克服干擾的測(cè)試。

對(duì)于每個(gè)樣品，建議采用多種稀釋倍數(shù)來評(píng)估緩解干擾后的樣品性能變化。
盡量多地利用微孔板上的21個(gè)樣品孔來加載和測(cè)試樣品和稀釋倍數(shù)。

評(píng)估每個(gè)樣品的PPC回收率和CV值，以確定在采取緩解干擾措施之后的最佳稀釋倍數(shù)。

如果測(cè)試結(jié)果顯示成功消除干擾，請(qǐng)進(jìn)行下面的部分C“加標(biāo)測(cè)試"。
如果未能消除干擾，請(qǐng)返回B.1或B.2部分，評(píng)估其它干擾源。

加標(biāo)測(cè)試：

加標(biāo)測(cè)試是可選程序，旨在進(jìn)一步證明Sievers Eclipse適用于BET測(cè)試。此外還要求進(jìn)行加標(biāo)研究，以確定樣品容器適用于測(cè)試樣品。

根據(jù)之前的分析結(jié)果，為每個(gè)樣品選擇一個(gè)或多個(gè)最佳稀釋倍數(shù)。

選擇一個(gè)或多個(gè)加標(biāo)濃度，證明Eclipse能夠回收微孔板上的添加內(nèi)毒素。

建議選擇高于標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的加標(biāo)濃度（1 EU/mL或更高），以提高內(nèi)毒素回收率。

按照生產(chǎn)商給的指導(dǎo)步驟來重構(gòu)內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）或內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）。

將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用水（LRW）稀釋至所需濃度。

留出足量的加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為稀釋液用于稀釋樣品。

用上述制備的加標(biāo)溶液將樣品稀釋至最佳稀釋倍數(shù)。

評(píng)估加標(biāo)樣品的原始內(nèi)毒素濃度，以確定是否成功回收正確的加標(biāo)濃度。

評(píng)估PPC回收率和CV值，以確認(rèn)前面的最佳稀釋倍數(shù)和緩解干擾方法的結(jié)果。

結(jié)論

對(duì)新產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，應(yīng)執(zhí)行以下程序：

初始的產(chǎn)品評(píng)估和稀釋倍數(shù)優(yōu)化

在對(duì)新產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)之前，應(yīng)先評(píng)估陽性產(chǎn)品對(duì)照（PPC）的回收率和變異系數(shù)（%CV），以檢測(cè)樣品基質(zhì)所造成的干擾（包括抑制和增強(qiáng)）。此階段的目標(biāo)是確定最佳產(chǎn)品稀釋倍數(shù)，從而將干擾降至可接受的范圍之內(nèi)。最佳稀釋倍數(shù)應(yīng)低于最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）。幾乎所有產(chǎn)品都會(huì)干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET），因此了解產(chǎn)品基質(zhì)非常重要。確定最佳稀釋倍數(shù)之后，就可以進(jìn)行產(chǎn)品驗(yàn)證。

產(chǎn)品驗(yàn)證程序：確保穩(wěn)健性和合規(guī)性

產(chǎn)品驗(yàn)證包括以最佳稀釋倍數(shù)測(cè)試3個(gè)不同批次的產(chǎn)品。這種多批次測(cè)試可以確保內(nèi)毒素檢測(cè)方法在測(cè)試不同批次產(chǎn)品時(shí)的一致性和穩(wěn)定性，符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）和法規(guī)要求。

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀：高效便捷的解決方案

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀可以高效運(yùn)行抑制/增強(qiáng)測(cè)試，以及上述3批次產(chǎn)品驗(yàn)證程序。此款檢測(cè)儀采用先進(jìn)的離心技術(shù)和動(dòng)態(tài)方法，簡(jiǎn)化了內(nèi)毒素檢測(cè)流程。上述優(yōu)點(diǎn)使得此款檢測(cè)儀能夠更快、更精確地報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，并提供準(zhǔn)確的定量分析和干擾分析。

Sievers Eclipse檢測(cè)儀的優(yōu)點(diǎn)還包括：

高效：自動(dòng)化功能減少了化驗(yàn)設(shè)置和移液的操作步驟，提高了通量。
直觀：直觀的用戶界面簡(jiǎn)化了操作步驟，減少了錯(cuò)誤，提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量。
合規(guī)性：此款檢測(cè)儀滿足有關(guān)藥典測(cè)試和數(shù)據(jù)可靠性的嚴(yán)格法規(guī)要求

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀是細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大的技術(shù)進(jìn)步，為持續(xù)進(jìn)行的產(chǎn)品驗(yàn)證需求提供了全面、高效、合規(guī)的解決方案，提高了產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

National Library of Medicine. (2023). J. Oliveira and W.C. Reygaert. Gram-Negative Bacteria.
Center for Disease Control. 2024. About Gram-negative Bacteria.

Sievers Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)：克服抑制/增強(qiáng)干擾的操作程序

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