一、方案概述

1.1 Calcein AM-PI雙色染色檢測原理

Calcein AM-PI雙染法是細胞原位活力檢測的常用熒光技術，依托染料的細胞膜通透性差異、細胞代謝活性差異，區分樣本中的活細胞與死細胞，適配各類貼壁細胞、懸浮細胞的活力篩查實驗。

Calcein AM為脂溶性熒光染料，可穿透細胞膜進入細胞內部。具備代謝活性的活細胞內含酯酶，可水解染料中的疏水基團，使染料滯留于細胞質中，在FITC通道激發下發出綠色熒光。失去代謝活性的死細胞無酯酶作用，無法產生綠色熒光信號。

PI碘化丙啶為核酸熒光染料，難以穿透結構完整的細胞膜，僅可進入細胞膜受損的死細胞內，與細胞核核酸結合后，在TRITC通道激發下呈現紅色熒光。

常規結果判定標準：活細胞呈現細胞質綠色熒光、無細胞核紅色熒光；死細胞呈現細胞核紅色熒光、無細胞質綠色熒光；晚期凋亡、重度損傷細胞會出現紅綠雙熒光信號。

1.2 LF500倒置熒光顯微鏡設備適配優勢

萊特LF500倒置熒光顯微鏡搭載無限遠獨立校正光學系統，機身采用鋁合金一體壓鑄成型，結構扎實、擴展性豐富，適配科研、教學、醫學檢驗領域的細胞熒光成像實驗，可良好匹配Calcein AM-PI雙色染色檢測的成像需求。設備多項硬件結構針對活細胞原位觀測優化，各項適配特點及圖文說明如下：

（1）24mm超大視場觀測系統，提升批量樣本篩查效率

設備標配WF10X/24mm大視場目鏡，相較于常規18mm、22mm視場目鏡，有效觀測視野范圍更大，單視野可覆蓋更多細胞區域，大幅縮短多孔板、批量樣本的視野尋找時間。搭配30°可360°旋轉鉸鏈式三目觀察筒，瞳距48-75mm、屈光度可調節，適配不同操作人員的觀測習慣，長時間實驗觀測不易疲勞。設備支持目視與數碼成像二檔分光切換，可同步完成肉眼觀察與圖像采集，操作便捷。

圖1 LF500整機原廠實拍圖

圖2 24mm大視場目鏡及三目觀察筒結構實拍圖

（2）可拆卸超長工作距離聚光系統，適配多規格培養載體

LF500搭載優化款超長工作距離聚光鏡，常規工作距離72mm，數值孔徑0.30，搭配非球面鏡片與可調光闌，整視場光照均勻柔和，可滿足常規6孔、12孔、24孔培養皿與培養板的明場、相襯、熒光觀測需求。聚光鏡支持完整拆卸，拆除后設備縱向操作空間可達160mm，可適配多層細胞工廠、大尺寸培養皿等高通量培養設備，支持細胞原位染色觀測，無需轉移細胞樣本，減少樣本損耗與污染風險。

圖3 LF500超長工作距離可拆卸聚光鏡結構實拍圖

（3）模塊化多通道LED熒光系統，適配雙色活死染色成像

設備采用可快速拆裝的模塊化熒光激發盒，分為電動款與轉盤式兩款結構可選，最多可拓展7個熒光通道，標配DAPI、FITC、TRITC三組標準濾光片組，精準匹配Calcein綠色活細胞熒光、PI紅色死細胞熒光的雙通道成像波段。設備搭載寬光譜大功率LED熒光光源，支持亮度無級調節，即開即用無需預熱，光源使用壽命長、維護成本低，光毒性較低，適配活細胞長時間觀測。同時可根據實驗需求定制Mcherry、CY5等專用濾光片，拓展多元熒光檢測場景。

圖5 LF500模塊化快拆熒光激發盒實拍圖

圖6 多通道熒光通道切換面板實拍圖

（4）大尺寸多功能柔性載物臺，適配高通量樣本定位

設備配備256×238mm大尺寸固定載物臺，XY軸移動行程136×90mm，移動范圍充足，可適配各類常規細胞培養容器。載物臺采用同軸齒輪與絲杠傳動結構，移動順滑平穩，臺面帶有縱橫刻度標記，便于96孔板等高通量樣本的快速孔位定位。搭配低手位同軸柔性XY移動手柄，支持多方向擺動調節，操作姿態更貼合人體工學。臺面預留多點拓展安裝孔，可外接輔助設備，適配長期、批量的細胞活力檢測實驗，可拆卸移動尺可滿足大型培養器皿的平整放置需求。

圖7 LF500大尺寸多功能載物臺實拍圖

圖8 低位柔性移動手柄結構細節實拍圖）

（5）多模式觀測兼容結構，豐富實驗觀測維度

設備搭載雙向推拉式相差板，可同時搭載10X、20X、40X專用相差環，支持明場、相襯、熒光三種觀測模式快速切換。染色前可通過相襯模式清晰觀察細胞鋪板密度、生長形態、貼壁狀態，提前篩選合格樣本；染色后可疊加明場、相襯、熒光多維度圖像，同步獲取細胞形態信息與活力數據，提升實驗數據完整性。設備配置快拆裝熒光護目板，可有效遮擋強激發光，降低光源對操作人員眼部的刺激，提升實驗安全性。

圖9 LF500雙向推拉式相差板實拍圖

（6）低位通光數碼成像系統，適配低光熒光采集

設備采用左下傾式100%通光成像接口，相機安裝后不會遮擋目視觀測光路，兼顧目視觀察與數碼采集雙重需求。成像通光率高，適配熒光低照度成像場景，可搭配230-2500萬像素多規格高靈敏度顯微相機，成像清晰度高、色彩還原度好。配套專業成像軟件，可完成圖像采集、保存、疊加、數據統計等基礎操作，軟件可定期迭代更新，適配不同實驗的數據處理與歸檔需求。

圖1 LF500低位同軸同步調焦手輪實拍圖

圖12 物鏡轉盤及防霉物鏡組實拍圖

二、實驗前期準備

2.1 試劑與耗材清單

1. Calcein AM-PI活死細胞雙色染色試劑盒；

2. 無血清細胞基礎培養基、細胞培養基；

3. 無菌PBS磷酸鹽緩沖液；

4. 6孔、12孔、24孔、96孔細胞培養板、細胞培養皿、細胞工廠；

5. 無菌離心管、移液槍、無菌吸頭、避光孵育盒等常規實驗耗材。

2.2 LF500顯微鏡上機調試步驟

1. 設備通電，依次開啟機身總電源、透射LED照明光源、熒光激發系統電源，設備光源無需預熱，開機即可投入使用。

2. 根據樣本容器規格調整聚光結構：常規多孔板、小型培養皿保留聚光鏡，利用72mm標準工作距離觀測；細胞工廠等大型容器拆除聚光鏡，使用160mm超大縱向空間，避免設備與樣本磕碰。

3. 將相差板切換至空白檔位，切換10X長工作距離相差物鏡，調節低手位同軸調焦手輪，完成對焦歸零與高程鎖定。

4. 調試熒光系統，依次切換FITC、TRITC通道，將熒光亮度調節至基礎檔位，規避熒光信號過曝問題，保證成像畫質均勻。

5. 根據樣本規格安裝對應載物托板，固定樣本位置，檢查設備各操作部件靈活性，完成上機前調試。

三、標準化實驗操作全流程

3.1 細胞樣本預處理

1. 取出完成藥物處理、造模培養的細胞樣本，緩慢吸除孔內原有細胞培養基，操作輕柔，避免沖刷損傷貼壁細胞。

2. 加入無菌PBS緩沖液輕柔洗滌細胞單層，清除殘留血清成分，血清中的游離酯酶會提前分解Calcein AM，提升背景熒光，干擾成像效果。

3. 洗滌完成后吸凈孔內殘留PBS，避免殘留液體稀釋染色工作液，影響染色效果。

3.2 Calcein AM-PI染色工作液配制

染色工作液需現配現用，全程避光操作。以24孔板單孔250μL體系為例，取適量無血清培養基，分別加入Calcein AM母液與PI母液，稀釋至實驗常用濃度（Calcein AM 2-5μM、PI 1-2μM），輕柔吹打混勻后備用。

3.3 細胞避光孵育染色

1. 向預處理后的細胞孔內加入配制完成的染色工作液，確保液體覆蓋細胞單層。

2. 將培養板放置于37℃避光孵育環境中，孵育15-30min，根據細胞類型可適當微調孵育時長。

3. 懸浮細胞可通過離心收集細胞沉淀，用染色工作液重懸后避光孵育，孵育完成后轉移至培養皿上機觀測。

3.4 LF500顯微鏡熒光成像操作

1. 樣本放置：孵育完成后取出細胞樣本，無需二次洗滌，平穩放置于LF500載物臺，固定樣本位置，避免觀測過程中移位。

2. 相襯預定位：推拉相差板切換至對應物鏡的相差環檔位，開啟透射光源，通過低手位調焦手輪粗調、微調，獲取清晰的細胞形態視野，標記目標觀測區域。

3. 綠色通道成像：啟動熒光系統，切換FITC激發通道，緩慢調節熒光亮度，待細胞綠色熒光信號清晰、無明顯背景干擾后，切換數碼成像模式，采集活細胞熒光圖像。

4. 紅色通道成像：切換TRITC激發通道，匹配紅色熒光成像亮度，采集死細胞細胞核熒光圖像。

5. 多維度成像：通過設備成像系統疊加明場、相襯、雙色熒光圖像，直觀區分活細胞、死細胞的分布狀態；切換20X、40X物鏡，可拍攝單細胞細節圖像，用于精細化分析。

3.5 圖像采集與細胞活力數據分析

1. 通過配套成像軟件統一保存單通道熒光圖像、多通道疊加圖像，留存原始實驗數據。

2. 依托軟件圖像分析功能，識別視野內綠色陽性活細胞、紅色陽性死細胞，統計總細胞數、活細胞數量，計算細胞存活率。

3. 整理成像圖片與數據報表，分類歸檔，便于后續實驗復盤與數據對比分析。

四、設備操作規范與實驗注意事項

1. 熒光染色樣本對光線敏感，實驗全程需做好避光處理，觀測時熒光亮度由低檔位逐步調節，減少熒光淬滅對成像效果的影響。

2. 觀測大型細胞培養容器時，務必拆除聚光鏡，預留充足縱向空間，防止物鏡與樣本碰撞，保護設備光學部件。

3. 實驗過程中避免培養液、試劑滴落至物鏡、載物臺等光學部件，若出現液體殘留，需用專用鏡頭紙輕柔擦拭清理。

4. 長時間活細胞動態觀測時，可適當降低熒光光源亮度、縮短曝光時長，降低光源對活細胞的影響。

5. 批量樣本檢測時，可利用設備多通道熒光切換功能與載物臺孔位標記，有序完成樣本成像，提升實驗效率。

6. 日常設備使用后，需清理載物臺污漬，關閉光源與設備電源，做好設備防塵養護，延長設備使用周期。

五、Calcein AM-PI法與AOPI法應用差異對比

1. 細胞適配性：Calcein AM染料生物相容性較好，染色后的細胞可用于后續培養實驗；AO染料存在一定生物毒性，染色后的細胞難以復用，僅適用于終點檢測。

2. 成像精準度：Calcein AM標記細胞質，可同步觀察細胞形態與活力狀態，細胞碎片不會產生干擾信號；AOPI法標記核酸，游離核酸、凋亡小體易產生雜信號，對計數結果存在輕微影響。

3. 樣本兼容性：搭配LF500超長工作距離結構，Calcein AM-PI法可適配細胞工廠、3D細胞球、類器官等厚層立體樣本；AOPI法更適配懸浮細胞快速計數，對厚層樣本觀測適配性一般。

4. 實驗拓展性：LF500多通道熒光系統可拓展多色熒光檢測，Calcein AM-PI法可搭配DAPI等染料開展多重標記實驗，適配多元化科研需求。

六、方案適用應用場景

1. 高校、科研院所細胞生物學實驗：細胞氧化應激損傷、缺氧損傷、藥物毒性干預等模型的細胞活力檢測。

2. 生物醫藥研發領域：抗腫瘤藥物、細胞保護類藥物的細胞水平篩選與效果驗證。

3. 干細胞與原代細胞研究：干細胞、原代培養細胞的活性鑒定與存活狀態觀測。

4. 高通量細胞培養檢測：細胞工廠、多孔板批量培養細胞的活力篩查與質量把控。

5. 教學與檢驗領域：院校熒光成像教學實驗、醫療衛生及檢驗檢疫相關細胞檢測工作。

七、LF500設備標準配置清單

1. LF500無限遠獨立校正光學倒置熒光顯微鏡主機（鋁合金壓鑄機身）

2. 30°傾斜鉸鏈式三目觀察筒，瞳距48-75mm可調，屈光度可調

3. WF10X/24mm平場大視野目鏡、對中望遠鏡

4. 長工作距離平場相差熒光物鏡：4X、10X、20X、40X、60X

5. 可拆卸超長工作距離聚光鏡，常規工作距離72mm，數值孔徑0.30

6. 雙向推拉式相差環板，適配10X/20X/40X相差觀測

7. 多通道模塊化熒光激發系統，標配DAPI、FITC、TRITC濾光組

8. 256×238mm大尺寸多功能載物臺、柔性低手位移動手柄

9. 可調亮度LED透射照明系統，配套多規格濾色片

10. 5/6孔防霉物鏡轉盤，滾珠定位，切換精準

11. 高靈敏度顯微成像相機（230-2500萬像素可選）、成像分析軟件

12. 快拆裝熒光護目板、多規格培養容器適配托板

八、方案總結

萊特LF500倒置熒光顯微鏡依托穩定的壓鑄機身結構、24mm超大視場光學系統、超長可拆卸工作距離聚光結構、多通道模塊化LED熒光系統，可良好適配Calcein AM-PI活死細胞雙色熒光染色檢測實驗。整套方案覆蓋樣本預處理、染色孵育、設備成像、數據分析全流程，操作規范、適配性廣。

設備可兼容常規培養板、大型細胞工廠、立體細胞樣本等多種實驗載體，兼顧基礎教學與科研篩查需求，模塊化設計可根據實驗需求拓展功能，適配多領域細胞活力檢測工作，具備較強的實用性與通用性。