ECLIPSE Ts2-FL倒置熒光顯微鏡在活/死細胞
雙色熒光染色（Calcein AM / PI 法）中的應用解決方案

基于 LED 復眼透鏡照明與遮光系統的標準化細胞活性檢測指南

圖 1：Nikon ECLIPSE Ts2-FL 倒置熒光顯微鏡整體結構

一、 應用背景與雙色熒光檢測原理

在細胞生物學、腫瘤學評估、藥物毒理學及組織工程領域，準確判斷細胞活力及質膜完整性是實驗分析的關鍵基礎。Calcein AM（乙氧基甲基熒光素阿醋酸酯）與 Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）聯合使用的雙色熒光染色法，能夠同步對同一視野下的活細胞與死細胞進行特異性標記，呈現高對比度的雙色成像效果。

1.1 雙色熒光探針的作用機制

二、 Ts2-FL倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術支撐

針對傳統熒光顯微觀察中存在的背景雜光干擾、激發光場不均、通道切換頻繁調光以及需要暗室環境等難點，ECLIPSE Ts2-FL 倒置熒光顯微鏡提供了多項創新設計支撐：

2.1 LED 結合內置復眼透鏡，實現均勻且高效的落射熒光照明

Ts2-FL 采用了高亮度落射熒光 LED 光源，并在光路中內置復眼透鏡（Fly-eye lens）。復眼透鏡能夠消除光源發光不均的現象，在整個觀察視場內提供高度一致的光強分布。LED 光源無需繁瑣的中心校準，即開即用且發光穩定，有效避免了因光源衰減或邊緣光衰導致的檢測偏差。

圖 2：Ts2-FL 內置落射熒光 LED 光源單元與帶噪聲消除機制的濾光塊轉盤

2.2 遮光板（Shield Plate）技術，支持在明亮室內進行高信噪比觀察

傳統熒光檢測強依賴暗室，操作繁瑣且易受環境限制。Ts2-FL 提供了可選的遮光板附件，可直接遮擋培養室或實驗室內的環境光。借助該技術，實驗人員無需關閉室內照明，即可直接在明亮的環境中獲得高對比度、高信噪比的雙色熒光圖像。

圖 3：遮光板（Shield Plate）阻擋室內雜光效果（左：打開遮光板；右：關閉遮光板）

2.3 自動照明強度記憶與噪聲消除機制

Ts2-FL 最多可配置三個落射熒光濾光塊。當在 Calcein AM（綠色）與 PI（紅色）通道之間切換時，系統能自動再現使用者之前針對該通道定義的激發光強度，無需每次手動重新調節光強，既簡化了操作流程，又減少了樣本因長時間暴露而發生的熒光淬滅。此外，集成的噪聲消除機制（Noise Terminator）可進一步吸收光路中的雜散光，顯著提升成像對比度。

2.4 纖巧機身設計與優化的人體工程學面板

Ts2-FL 機身緊湊，可輕松安放于超凈工作臺或細胞培養罩內部。透射照明與落射熒光照明開關分別置于機身面板前側與兩側，操作布局直觀合理。機械載物臺與多樣化托板（如皮氏培養皿托板 C-S-HP35、通用托板 C-S-HU 等）能夠穩定承載培養板、培養皿與微型板，確保微位移平穩無振動。

圖 4：Ts2-FL 人體工程學控制按鍵與多功能機械載物臺布局

三、 活/死細胞雙色熒光檢測標準解決方案流程

為獲得重復性高、熒光漂光少且定量準確的檢測結果，建議采用以下規范化操作流程：

步驟 1：試劑準備與工作液配制

• 取 Calcein AM 與 PI 儲存液，使用無熒光背景的無血清培養基或 PBS 緩沖液按推薦比例稀釋。

• 建議工作終濃度：Calcein AM 約 1.5–2.0 μM，PI 約 3.0–5.0 μM，現用現配，注意避光保存。

步驟 2：細胞處理與孵育染色

• 待測細胞（貼壁或懸浮細胞于 96 孔板或 35 mm 培養皿中）先用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1 次，除去培養基中血清酯酶的干擾。

• 加入配制好的 Calcein AM / PI 雙染色工作液，確保覆蓋細胞層。

• 置于 37°C、5% CO? 細胞培養箱中避光溫育 15–20 分鐘。

步驟 3：Ts2-FL 上樣與明場/相襯區域定位

• 將培養器皿置于 Ts2-FL 載物臺上，通過專用托板固定。

• 開啟透射 LED 照明，切換至相差（Phase Contrast）或浮雕反差（Relief Contrast）模式，使用 10X 或 20X 物鏡快速尋找代表性視野并對焦。

步驟 4：熒光通道切換與圖像采集

• 展開 Ts2-FL 遮光板，阻擋環境雜散光。

• 綠色通道（Calcein AM）：切換至 GFP/FITC 濾光塊，LED 熒光照明開啟，系統自動再現預設光強，對焦并采集綠色胞質熒光圖像（活細胞）。

• 紅色通道（PI）：電動/手動滑動轉盤至 TRITC/Texas Red 濾光塊，采集紅色胞核熒光圖像（死細胞）。

步驟 5：NIS-Elements 軟件疊加與定量分析

• 通過 Side Camera Port 掛載的 Digital Sight 系列數字相機（如彩色相機 DS-Fi2 / DS-Ri2）傳輸圖像。

• 利用 NIS-Elements 圖像軟件完成通道疊加（Fusion）及細胞計數分析，輸出活細胞比例與死細胞比例數據。

四、 典型圖像結果與數據評估

在 ECLIPSE Ts2-FL 的高質量光學表現下，Calcein AM / PI 雙色染色呈現出界限分明的形態與光譜特征：

圖 5：使用 NIS-Elements 軟件合成的多通道熒光圖像（展示高清晰度與極低背景噪聲）

五、 規范操作注意事項與設備保養建議

5.1 孵育時間控制：染色孵育時間不宜過長（建議控制在 15–20 分鐘內）。若孵育過久，Calcein 可能逐漸滲出胞外增加背景，或 PI 少量被活細胞內吞產生假陽性。

5.2 激發光功率調節：充分利用 Ts2-FL 的光強記憶功能，在滿足相機曝光的前提下適當調低 LED 激發強度，以減緩熒光探針的淬滅速度。

5.3 遮光板使用與清潔：在明亮房間觀察時請確保遮光板覆蓋光路。遮光板及載物臺表面若沾染培養基或染色液，應用濕潤無塵紙輕輕擦拭干凈。

5.4 光學鏡片保養：高倍物鏡（如 20X、40X）前透鏡表面需定期檢查，如有灰塵，應用氣吹或專用的無塵紙沾取無水乙醇進行清潔，保持良好的透光性能。