外周巨噬細胞高表達Gal3，且病灶處Gal3陽性細胞不共表達腦固有小膠質細胞標志物TMEM119，以上兩點提示這類細胞經血液循環浸潤至腦組織。因此，為改善腦微出血（CMB）后毛細血管丟失問題，本研究通過靜脈注射荷蘭Liposoma氯膦酸鹽脂質體（CLR）耗竭小鼠循環巨噬細胞。
氯膦酸鹽脂質體（ClodronateLiposomes：C-005）被循環吞噬細胞攝取后，會在吞噬溶酶體內降解，釋放包裹的氯膦酸并誘導細胞凋亡。與預期結果一致，CLR 處理可顯著耗竭血液中的單核細胞與中性粒細胞（圖 6A），但對淋巴細胞、紅細胞無明顯影響（獨立樣本 t 檢驗，P=0.10）。研究同時發現，CLR 處理后小鼠脾臟 Gal3 陽性巨噬細胞數量大幅下降（圖 6B、附圖 S6A；獨立樣本 t 檢驗，P=0.0005）；而小膠質細胞特異性清除劑 PLX5622 對該類細胞無作用（圖 6B）。靜脈 CLR 僅靶向清除外周免疫細胞：與其他嚙齒類動物研究報道一致，CLR 處理后小鼠大腦皮層小膠質細胞密度無顯著改變（附圖 S6B、C；單因素方差分析，F?,??=0.6762，P=0.5164）。
在證實 CLR 可有效清除血液循環及外周器官中能分化為浸潤巨噬細胞的前體細胞后，本研究對糖尿病小鼠分別進行空白對照溶劑、CLR 給藥處理；給藥時間點為腦微出血造模前、造模當日及造模后第 2 天。首先驗證：CLR 處理可顯著抑制糖尿病小鼠病灶處 Gal3?/TMEM119?浸潤巨噬細胞的募集浸潤（圖 6C、D；單因素方差分析，F?,??=14.48，P＜0.0001；圖基多重比較檢驗：糖尿病組 vs 糖尿病 CLR 給藥組，P=0.0344）。值得注意的是，CLR 不會改變病灶處 TMEM119?固有小膠質細胞（無論是否共表達 Gal3）的數量（圖 6C、D；單因素方差分析，F?,??=0.7862，P=0.7862）。該結果進一步證實：腦內原生 TMEM119?/Gal3?小膠質細胞不會損傷血管修復進程，與外周浸潤型 TMEM119?/Gal3?巨噬細胞作用相反。
糖尿病小鼠腦微出血病灶內 Gal3 免疫熒光染色面積顯著擴大，且該信號與固有小膠質標志物 TMEM119 無共定位；而 CLR 給藥可逆轉該現象（圖 6E；單因素方差分析，F?,??=45.49，P＜0.0001；圖基多重比較檢驗：糖尿病組 vs 糖尿病 CLR 給藥組，P＜0.0001）。
為進一步探究 CLR 對出血灶吞噬活性及相關信號蛋白的調控作用，本研究對腦微出血病灶進行成像定量檢測，檢測指標包括脂褐素含量、CD68、髓系細胞觸發受體 2（TREM2）免疫熒光強度（文獻 41）；前期基因表達譜分析已證實上述標志物表達上調（見圖 4A）。結果顯示：相較于空白溶劑處理的糖尿病小鼠，CLR 給藥糖尿病小鼠腦微出血病灶中 GFP 陽性細胞聚集區對應的脂褐素熒光面積顯著降低（圖 6F；單因素方差分析，F?,???=4.313，P=0.0366；圖基多重比較檢驗：糖尿病組 vs 糖尿病 CLR 給藥組，P=0.0236）。
由于 Gal3 染色方案與 CD68、TREM2 染色存在實驗沖突（抗原修復需高溫處理、一抗宿主物種不匹配），本研究將三種蛋白的染色結果分開展示。CLR 處理可顯著降低糖尿病小鼠病灶內 CD68 免疫熒光染色面積占比（圖 6G、H；單因素方差分析，F?,??=5.857，P=0.0051；圖基多重比較檢驗：非糖尿病組 vs 糖尿病組，P=0.0222；糖尿病組 vs 糖尿病 CLR 給藥組，P=0.0078），但不改變 CD68 點狀熒光的數量（圖 6I；CD68 點狀顆粒數量：單因素方差分析，F?,??=0.4932，P=0.6135）。糖尿病小鼠腦微出血病灶中 TREM2 表達同樣升高，CLR 給藥可顯著下調其表達水平（圖 6J、K；單因素方差分析，F?,??=7.112，P=0.0019；圖基多重比較檢驗：非糖尿病組 vs 糖尿病組，P=0.0058；糖尿病組 vs 糖尿病 CLR 給藥組，P=0.0051）。以上結果說明：糖尿病狀態會提升出血灶吞噬活性與 TREM2 蛋白表達，而 CLR 干預可將二者下調至健康對照組正常水平。
為驗證假說 ——Gal3 陽性巨噬細胞是體內決定血管最終轉歸的核心因素，本研究構建非糖尿病小鼠、糖尿病小鼠模型，分別設置 CLR 給藥 / 空白對照；于腦微出血造模后連續 2 周活體成像，追蹤 CX3CR1-GFP 標記的小膠質 / 巨噬細胞應答與微血管轉歸（圖 7A）。活體實驗結果顯示：未經 CLR 處理的糖尿病小鼠，腦微出血后約 29% 微血管發生消亡；而 CLR 干預可將微血管消亡比例大幅降至 5%（圖 7A、B）。對各組小鼠血管修復 / 消亡比例取均值后，同樣觀察到該趨勢（圖 7C）。
補充說明：糖尿病 CLR 給藥組僅出現 2 例血管消亡（共 37 根觀測血管），且全部來自同一只小鼠；其余 7 只接受 CLR 處理的糖尿病小鼠，腦微出血后微血管均實現 100% 修復（圖 7B、C）。綜上，上述活體實驗證實：CLR 可阻斷 Gal3 陽性巨噬細胞浸潤出血病灶，進而抑制糖尿病小鼠腦微血管消亡。
圖6. 氯膦酸脂質體干預可清除外周免疫細胞、減少TMEM119?/Gal3?細胞浸潤，并降低出血灶處的吞噬活性
論文信息：
論文題目：Invasion of phagocytic Galectin 3 expressing macrophages in the diabetic brain disrupts vascular repair
期刊名稱：Science Advances
時間期卷：Vol 7, Issue34(2021)
在線時間：2021年8月18日
DOI: 10.1126/sciadv.abg2712
產品信息：
貨號：CP-005-005
規格：5ml+5ml
品牌：Liposoma
產地：荷蘭
名稱：Clodronate Liposomes&Control Liposomes
辦事處：靶點科技
Clodronate Liposomes氯膦酸鹽脂質體靜脈注射，清除外周巨噬細胞。荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑ClodronateLiposomes見刊于Science Advances：吞噬型半乳糖凝集素 3 陽性巨噬細胞浸潤糖尿病小鼠腦組織會阻礙血管修復。
Liposoma巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes氯膦酸二鈉脂質體清除巨噬細胞的材料和方法：
In vivo macrophage depletion
For drug intervention experiments, mice received intravenous CLR (50 mg/kg; Liposoma B.V.) 2 days before CMB induction, on the day of CMB induction, and 2 days later. This treatment regimen ensured sustained depletion of peripheral macrophages. Diff-Quik histological staining confirmed depletion of circulating immune cells in treated animals.
藥物干預實驗中，于腦微出血造模前 2 天、造模當日及造模后 2 天，對小鼠尾靜脈注射氯膦酸二鈉脂質體（CLR，給藥劑量 50 mg/kg，廠商：Liposoma B.V.）。該給藥方案可實現外周巨噬細胞的持續性清除。經迪夫快速（Diff-Quik）組織染色驗證，給藥小鼠外周循環免疫細胞已被有效清除。
巨噬細胞清除材料和方法文獻截圖：吞噬型半乳糖凝集素 3 陽性巨噬細胞浸潤糖尿病小鼠腦組織會阻礙血管修復
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