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本文要點：為實現精準疾病診斷，高發光效率的熒光探針至關重要。為克服近紅外二區（NIR-II）有機染料長期存在的量子產率低的局限，本文巧妙地設計了一種聚集誘導發光（AIE）發光體TPE-Hexoxyl。通過協同抑制π-π堆積并最小化分子內電荷轉移，構建出NIR-II納米顆粒，其亮度位居已報道有機探針之列（熒光量子產率ΦPL = 0.9%）。體外研究表明，TPE-Hexoxyl納米顆粒具有優異的膠體穩定性與顯著的光穩定性。活體成像顯示其具備高空間分辨率與長效組織滯留能力，可實現對全身血管系統、腦微血管網絡及淋巴系統的動態高對比度可視化。尤為突出的是，TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位4T1荷瘤小鼠模型中對腫瘤病灶的檢測靈敏度顯著提升，并能精確繪制炎癥性腸病模型中炎癥區域的空間分布，凸顯其在臨床病理診斷中的變革性潛力。本研究確立了一種用于設計高亮度有機NIR-II熒光團的分子調控范式，為后續臨床診斷應用提供了分子工具。
方案1. 制備及體內應用NIR-II AIE NPs（TPE-Hexoxyl NPs）用于生物影像
圖1. TPA-Hexoxyl和B)TPE-Hexoxyl的分子結構及表征
TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl化合物以TPA和TPE作為分子轉子和電子供體合成（圖1A,B）。兩種化合物均具有典型的D?π?A?π?D結構，其中BBTD作為強電子受體。
為闡明其電子性質，進行了密度泛函理論（DFT）計算。優化后的基態（S?）幾何結構顯示，占據分子軌道（HOMOs）主要定域于噻吩π橋和BBTD核心，而占據分子軌道（LUMOs）則集中于BBTD核心（圖1C）。盡管TPE單元的電子供體能力弱于TPA，導致TPE-Hexoxyl的HOMO-LUMO能隙（1.61 eV）略大于TPA-Hexoxyl（1.33 eV），但減弱的D?A相互作用有效緩解了TICT效應，從而保證了較高的量子產率。如圖1D所示，TPE-Hexoxyl在S?與激發態（S?）之間存在顯著結構差異，均方根偏差（RMSD）為11.2 ?，表明光激發后發生明顯幾何變化。這種大偏差由激發誘導的電子重排驅動，導致顯著的結構弛豫，涉及鍵長、鍵角及整體構象的大幅位移。
光物理表征表明，兩種化合物在500–850 nm范圍內具有強吸收，并在900–1200 nm區域表現出強熒光發射，凸顯其在NIR-II成像中的潛力（圖1E）。此外，TPE-Hexoxyl在聚集態下展現出顯著增強的NIR-II熒光，表明非輻射衰減被有效抑制。在THF/水混合溶液中的聚集行為顯示，盡管兩種化合物在THF中熒光微弱，但隨著水含量增加，其發射顯著增強，表現出典型的聚集誘導發光（AIE）特征（圖1F）。為評估其TICT效應，研究了兩種分子在不同溶劑中的光譜特性。值得注意的是，TPE-Hexoxyl的發射強度下降程度低于TPA-Hexoxyl，表明其TICT效應弱于TPA-Hexoxyl。
為提升其在生物成像中的適用性，采用生物相容性兩親性聚合物DSPE-mPEG2K作為載體，通過納米沉淀法制備了水分散性納米顆粒（NPs）。動態光散射（DLS）與透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，TPE-Hexoxyl NPs與TPA-Hexoxyl NPs均呈球形膠束結構，流體動力學直徑分別為72 nm和98 nm（圖1G），在水溶液中Zeta電位分別為?20 mV和?21 mV（圖1H）。如圖1I所示，兩類納米顆粒的熒光強度較其單分子溶液顯著增強，凸顯其聚集誘導發光（AIE）特性。
隨后，對其熒光發射特性進行了系統評估。盡管在808 nm激發下，TPE-Hexoxyl NPs的摩爾消光系數（? = 4400 M?1 cm?1）低于TPA-Hexoxyl NPs（? = 10700 M?1 cm?1），但以IR-26為參照時，TPE-Hexoxyl NPs的相對熒光量子產率（ΦPL = 2.53%）顯著高于TPA-Hexoxyl NPs（ΦPL = 0.69%）（圖1J）。為直觀評估其光學性能，計算了定義為? × ΦPL的熒光亮度。定量分析顯示，在808 nm激光激發下，TPE-Hexoxyl NPs的亮度值達1.11 m?1 cm?1，較TPA-Hexoxyl NPs（0.74 m?1 cm?1）提升約50%（圖1K），這一提升對高信背比（SBR）成像至關重要。此外，當采用更剛性的聚苯乙烯（PS）-PEG5K作為載體時，TPE-Hexoxyl在水溶液中的ΦPL進一步提升至3.67%（圖1J）。鑒于TPE-Hexoxyl NPsΦPL，進一步測定其量子產率，結果達0.9%。此外，TPE-Hexoxyl NPs在PBS緩沖液及10%胎牛血清（FBS）中連續7天保持穩定的粒徑分布。與吲哚菁綠（ICG）相比，該納米顆粒在0.8 W/cm2功率密度的808 nm激光照射20分鐘后表現出極低的光漂白（圖1L），表明其具備優異的光穩定性和膠體穩定性，適用于長期活體成像。
圖2. 體外近紅外二區熒光成像、組織穿透深度及生物相容性評估
TPE-Hexoxyl NPs在不同濃度下的NIR-II熒光強度（偽青色）通過小動物成像系統捕獲。圖像顯示熒光強度隨濃度增加而增強，可在寬濃度范圍內實現成像應用。在不同長通（LP）濾波器（1000?1250 nm）下亦觀察到明亮發射，但波長越高，強度越低（圖2A）。為定量評估組織穿透能力，使用808 nm激光激發體外組織模擬仿體（雞胸組織），并采用優化的NIR-II成像參數（1000 nm LP濾波器、8000 mA電流、200 ms曝光時間）。如圖2B、C所示，TPE-Hexoxyl NPs的熒光強度隨組織厚度呈指數衰減，在50 mm穿透深度時接近背景水平。這種增強的組織穿透能力源于納米顆粒的高ΦPL與NIR-II光譜窗口固有的生物光子學優勢之間的協同作用，即散射系數降低和自體熒光抑制。
在開展體內研究前，系統評估了TPE-Hexoxyl NPs的生物安全性，包括其在808 nm激光照射（57.9 mW cm?2，5 min）下的光熱性能。光熱實驗表明，即使濃度高達200 µM，TPE-Hexoxyl NPs僅引起溫和的溫度升高（ΔT ≈ 3 °C），表明其光熱加熱效應可忽略不計。在此基礎上，使用人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）、小鼠胚胎成纖維細胞（3T3）和小鼠成纖維細胞（L929）進行的細胞毒性實驗顯示，在濃度高達100 µM時，未觀察到顯著細胞毒性（細胞存活率 > 95%）或對這些正常細胞增殖的抑制作用（p > 0.05）（圖2D）。這些結果證實了TPE-Hexoxyl NPs優異的生物相容性。
溶血實驗進一步揭示了其血液相容性：在100 µM濃度下，溶血率為1.20% ± 0.04%（圖2E），顯著低于ISO 10993–4國際標準規定的5%安全閾值。通過尾靜脈注射對正常小鼠進行藥代動力學評估顯示，給藥后1小時內血漿濃度迅速下降（圖2F），歸因于納米顆粒快速的全身分布能力，有效減少了局部組織蓄積引起的系統毒性并縮短了代謝周期。這一快速分布特性為高亮度AIEgen的體內生物成像提供了顯著優勢。基于模型計算的關鍵藥代動力學參數如下：消除半衰期（t?/?）為45.922 h，平均滯留時間MRT(0-t)為11.511 ± 1.331 h，藥物暴露量AUC(0-t)為6841.188 ± 582.429 mg·L?1·h?1。
TPE-Hexoxyl NPs獨特的水分散納米結構（流體動力學尺寸72.70 ± 0.68 nm，Zeta電位?20.97 ± 0.32 mV）是其生物學行為的基礎，促進了有效的網狀內皮系統（RES）攝取。生物分布研究揭示了時間依賴性的積累模式：注射后24 h，TPE-Hexoxyl NPs主要富集于RES器官，包括肝臟（11.89% ID/g）、脾臟（0.40% ID/g）、腎臟（0.40% ID/g）和肺部（0.41% ID/g），心臟分布極低（0.17% ID/g）（圖2G）。至72h，肝臟攝取增至26.94% ID/g（圖2H），而其他器官在7天后均低于檢測限，僅肝臟殘留22.30% ID/g、脾臟殘留0.32% ID/g（圖2I）。該分布特征與納米顆粒的理化特性密切相關：適宜的尺寸（≈70 nm）促進肝竇內皮通透性，而強負表面電荷最小化非特異性細胞吸附，共同推動RES介導的攝取與代謝。
圖3. 血管網絡和淋巴結的體內近紅外二區（NIR-II）熒光成像
在TPE-Hexoxyl NPs表現出良好生物相容性及優異的體外NIR-II成像潛力的基礎上，本文進一步評估了其在健康小鼠中的血管成像與淋巴結可視化性能。納米顆粒通過尾靜脈注射給藥（200 µL，1 mM濃度）。為更清晰地揭示微血管成像趨勢，開展了平行實驗（N = 7）。成像采用配備1000、1100、1200、1300、1400和1500 nm長通（LP）濾波器的InGaAs相機，記錄腹側與背側方向的血管造影特征（圖3A）。成像結果清晰展現了全身血管網絡，后肢微血管及動靜脈間組織結構在穿透皮膚與組織層后仍可明確分辨，凸顯了高熒光強度對成像質量的關鍵作用。隨著LP濾波器波長增加，血管信號顯著性與成像效能逐步提升。定量統計分析表明，后肢血管（以白色虛線標示）在1400 nm波長下成像性能，其平均半高寬（FWHM）最小（0.479 ± 0.029 mm），平均信背比（SBR）（10.649 ±1.935）（圖3B、C）。該組間極小變異證實了成像結果的高度平行性。耳部毛細血管網絡同樣在1400 nm下獲得FWHM與SBR指標（圖3D）。頭皮剝離后對腦微血管的進一步觀察顯示，使用1400 nm濾波器可清晰呈現小腦血管結構，包括表淺靜脈、上矢狀竇與橫竇（圖3E）。足墊注射后5分鐘內，納米顆粒在內側腘淋巴結與坐骨淋巴結區域顯著富集（圖3F）。關鍵的ICG共示蹤實驗表明，納米顆粒與經典淋巴示蹤劑在淋巴管、腘淋巴結及坐骨淋巴結中的分布模式近乎一致，證實了其*的淋巴結靶向能力。綜上，這些結果充分驗證了TPE-Hexoxyl NPs在體內NIR-II熒光成像中的應用潛力。
圖4. TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位乳腺癌小鼠模型中的體內近紅外二區熒光成像
腫瘤成像在癌癥診療一體化中發揮著關鍵作用，增強滲透與滯留（EPR）效應使納米顆粒能夠實現腫瘤特異性富集，從而支持精準診斷。 在全面評估TPE-Hexoxyl NPs在健康小鼠全身血管網絡與淋巴結的NIR-II熒光成像性能后，本文進一步構建了原位4T1乳腺癌模型，以評價其體內腫瘤靶向能力。如圖4A所示，通過NIR-II熒光成像系統（激發波長：808 nm，發射濾光片：1000 nm LP，電流值：3000 mA）進行實時監測，揭示了靜脈注射納米顆粒在腫瘤部位的時間依賴性富集特征。定量分析（圖4B）表明，腫瘤熒光強度在48 h達到峰值，隨后逐漸下降；值得注意的是，強熒光信號可持續至192 h，僅較峰值強度降低37.28%，從而證實TPE-Hexoxyl NPs具有腫瘤靶向能力與長效滯留特性。為明確生物分布特征，于注射后192 h處死小鼠進行離體分析。切除腫瘤及主要器官的熒光成像（圖4C）結合半定量區域興趣評估（圖4D）顯示，納米顆粒在腫瘤組織、肝臟和脾臟中呈現顯著富集。該分布模式在機制上與網狀內皮系統（RES）介導的納米顆粒截留及腫瘤特異性EPR效應的協同作用一致。至關重要的是，對腫瘤組織及主要器官（心、肝、脾、肺、腎）的H&E染色切片進行組織病理學檢查，未觀察到炎癥浸潤、細胞空泡化或壞死等病理改變，組織結構完整，進一步佐證了該納米平臺良好的生物相容性。
圖5. 炎癥性腸病小鼠模型中TPE-Hexoxyl納米顆粒的體內近紅外二區熒光成像
TPE-Hexoxyl在乳腺癌NIR-II成像中展現出病灶靶向能力的基礎上，接著利用右旋糖酐（DSS）誘導的炎癥性腸病（IBD）小鼠模型，探究該納米平臺在體內的炎癥靶向特異性。如圖5A所示，BALB/c小鼠被隨機分為DSS誘導組（N = 4）和對照組（N = 4）。模型組小鼠連續8天自由飲用含3%（w/v）DSS的飲水，隨后改用普通飲水恢復4天，以模擬疾病進展與緩解過程；對照組小鼠在整個實驗期間均飲用普通飲水。每日監測顯示，DSS處理組小鼠自第4天起出現進行性體重下降，至第8天體重降至對照組的81.02%（p < 0.001），并伴有明顯血便（圖5B、C），證實IBD模型成功建立且具備典型臨床表型。所有小鼠于第10天經尾靜脈注射200 µL、1 mM的TPE-Hexoxyl NPs。為精確解析信號空間分布，在處死后48 h進行離體NIR-II熒光成像（1000 nm LP濾光片），并使用InGaAs相機系統對兩組小鼠的結腸組織進行系統性成像分析。
離體腸道NIR-II成像顯示，兩組小鼠的小腸段均未檢測到顯著熒光信號（圖5D）。特異性熒光信號主要定位于結腸壁組織，通過Image J軟件進行定量分析證實，DSS處理組結腸的NIR-II信號強度顯著增強（圖5E、F）。值得注意的是，DSS誘導的結腸炎導致結腸顯著縮短（7.0 ± 0.5 cm vs 8.9 ± 0.4 cm，p < 0.05，圖5F），這一宏觀指標反映了炎癥性水腫、免疫細胞浸潤及組織損傷的嚴重程度。從高熒光強度區域精確采集的結腸組織切片進行組織病理學評估進一步驗證了上述結果：DSS處理組結腸呈現典型炎癥改變，包括密集的炎癥細胞浸潤、隱窩結構紊亂及廣泛的上皮潰瘍，而對照組腸道組織結構保持完整（圖5G）。這些發現共同確立了一種基于可視化精準評估炎癥性腸病（IBD）的新型分子成像工具。
參考文獻
Lin D, Huang W, Yang H, et al. Ultrabright NIR‐II Nanoparticles for High‐Resolution In Vivo Imaging: From Systemic Vasculature Visualization to Pathological Microenvironment Monitoring[J]. Advanced Materials, 2025: e10493.
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動物活體熒光成像系統 - MARS
In Vivo Imaging System
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恒光智影
上海恒光智影醫療科技有限公司，被評為“上海市專精特新中小企業"，獲國家“重大科學儀器研發專項"支持，榮獲上海市“科技創新行動計劃"科學儀器項目、上海市2025年度關鍵技術研發計劃“計算生物學"項目。
恒光智影，致力于為生物醫學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供一體化的成像解決方案。
專注動物活體成像技術，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術。
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