本文要點：聚合物膠束（PMs）的體內穩定性一直是研究者們長期爭論的焦點。本研究通過直接分析生物樣本中完整的膠束納米載體，重新審視了這一關鍵問題。本文建立了一種密度梯度超速離心（DGUC）方法，直接從生物組織中分離出完整的聚合物膠束，并采用了聚集誘導猝滅（ACQ）探針進行近紅外二區（NIR-II）成像，從而實現了對膠束完整性的實時監測和精確定量。結果表明，mPEG??-PLA??聚合物膠束在循環中保持結構穩定性超過16小時。更重要的是，脂蛋白，特別是低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），被鑒定為通過捕獲共聚物而破壞聚合物膠束穩定性的主要血清成分，而白蛋白的影響則微乎其微。這種相互作用通過瓊脂糖凝膠電泳和表面等離子體共振得到了驗證，揭示了脂蛋白與聚合物膠束之間存在納摩爾級的親和力結合。系統循環過程中聚合物膠束密度的隨時間增加表明膠束結構內存在內源性成分交換。結合密度梯度超速離心分離與基于聚集誘導猝滅的追蹤技術的綜合方法，為聚合物膠束納米載體的體內命運提供了見解，解釋了其在循環中的延長存在，同時闡明了脂蛋白驅動的聚合物膠束結構穩定和隨后解聚的機制。這些發現解決了先前在聚合物膠束穩定性評估中的差異，并為膠束藥物遞送系統的臨床轉化提供了關鍵的實驗支持。

PMs作為藥物遞送載體因尺寸小、循環時間長、易制備和功能化而備受關注，但臨床轉化率低，主要因對其體內機制了解不足。靜脈注射后，PMs面臨稀釋、高剪切力及與內源性成分相互作用等挑戰，引發對其結構穩定性的質疑。監測膠束完整性對理解藥物釋放機制和載體功能至關重要。早期研究使用放射性標記發現膠束在低于CMC時仍有較長血液循環時間，但后續基于F?rster共振能量轉移（FRET）的熒光標記研究結果不一致，凸顯了評估的不確定性。FRET方法存在信號衰減、再照明干擾和定量挑戰等問題，本研究采用ACQ探針，通過熒光強度與顆粒質量的正相關關系精確追蹤PMs結合動力學，提供了更識別和定量完整PMs的能力。此外，從生物介質中回收膠束具挑戰性，本研究采用密度梯度超速離心法從血清中回收膠束，并提出了綜合方法，包括使用NIR-II ACQ熒光團標記、實時體內穩定性評估、回收PMs以直接觀察完整性及分析組分與PMs相互作用。結果表明，模擬Genexol-PM®的mPEG-PLA PMs保持了結構完整性，體內循環超16小時，并逐漸通過與脂蛋白（尤其是LDL）相互作用解聚，為PMs作為納米載體的實用性提供了實驗支持。

圖1. 基于ACQ標記的密度梯度超速離心（DGUC）法從血清中回收mPEG2k-PLA2k微粒（PMs）

圖1A展示了基于吖啶橙（ACQ）的熒光標記原理，用于監測顆粒膜（PM）的完整性。當ACQ熒光團（ACQ1）被包裹在完整PM的疏水核心中時，其熒光被激活。PM解離后，釋放的探針分散到水環境中，在疏水相互作用驅動下迅速聚集，導致熒光立即且猝滅。這一機制建立了熒光信號與完整PM存在之間的正相關性，從而能夠識別和定量PM。水敏感性曲線（圖1B）顯示，當水含量超過40%時，ACQ1熒光在DMSO/水二元體系中猝滅，證實了其易受水環境影響的特點。圖1C展示了ACQ1在測定mPEG??-PLA??的臨界膠束濃度（CMC）中的成功應用，證實了其報告PM完整性的能力。之前的研究已驗證了這種使用ACQ標記評估PM完整性的方法。

DGUC是一種成熟的方法，用于分離血清脂蛋白。圖1D展示了HDL、LDL和VLDL的成功分離，在用蘇丹黑（一種選擇性結合脂蛋白親脂域的染料）染色后，它們表現為三條清晰的黑色帶。該DGUC方案應用于與血清孵育的PMs，以分散在PBS中的PMs作為對照。圖1E（左）顯示，DGUC有效地將純PMs（PBS分散液）濃縮成位于LDL和HDL層之間的單個清晰藍色帶。熒光成像證實了代表完整PMs的信號與該藍色帶的共定位。梯度中其他位置沒有可辨認的藍色，表明探針泄漏可忽略不計，并間接驗證了PMs在超離心力下的完整性。進一步的定量結果顯示，從PBS中回收PMs的效率為92.5±1.5%，表明DGUC工作流程對PMs的完整性和回收率影響極小。

令人鼓舞的是，當對PM-血清孵育物進行DGUC時，完整的PM被成功分離，在與PBS分散的PM對照相同的位置出現一條藍色條帶（圖1E，右）。為了確認回收的熒光信號僅來源于完整的PM，而非內源性血清成分，對從DGUC中回收的“PM"組分進行了基于PEG的免疫沉淀。該方法利用抗PEG抗體結合PM表面的PEG鏈和蛋白G瓊脂糖的能力，通過低速離心形成復合物并沉淀。通過依次與抗PEG抗體和蛋白G瓊脂糖孵育，從PBS分散中回收的PM被沉淀（圖S2A）。為了防止血清樣本中內源性免疫球蛋白的競爭性結合，首先將抗PEG抗體與蛋白G瓊脂糖交聯（圖1F）。圖1G和1H顯示，從PM-血清孵育物中回收的“PM"中，>98%的熒光信號被沉淀，表明非PM相關的熒光信號可忽略不計。這些免疫沉淀結果為DGUC分離和鑒定PM的準確性提供了強有力的間接驗證。最后，為了排除DGUC后熒光恢復是由ACQ1探針再發光（去猝滅）而非完整PM存在引起的可能性，評估了DGUC后ACQ1的猝滅狀態。基于之前的發現，即新合成的NIR-II探針在血清或體循環中孵育24小時后表現出極低的再發光，研究者進一步使用DGUC方法證實了這一低再發光特性。圖1I顯示，DGUC后，PBS中預猝滅的ACQ1濃縮成單層（藍色條帶），管內其他位置未檢測到熒光。此外，研究者還量化了不同濃度下血清中預猝滅ACQ探針的再發光情況。如圖1J所示，在相同探針濃度下，LDL層中的再發光信號不到顆粒膜（PM）層中的5%。

圖2. PMs體外穩定性研究

已建立的DGUC方法用于體外分析聚合物微粒（PMs）的穩定性。圖2A顯示了通過IVIS觀察到的不同熒光帶，證實了與血清孵育不同時間（5分鐘、1小時、4小時、8小時）后完整PMs的存在。熒光信號隨時間逐漸減弱，表明原始PMs發生了漸進性改變，這可能是由于膠束解聚或與血清成分的相互作用。有趣的是，隨著時間的推移，低密度脂蛋白（LDL）層內出現了一個新的熒光帶，且隨著孵育時間的延長而增強（圖2A和2B）。與圖1J中顯示的相應信號相比，該熒光帶的強度明顯更強。可以排除內源性成分干擾作為來源。相反，在LDL-PM相互作用過程中，探針轉移是一個更合理的解釋。鑒于LDL的顆粒結構具有高度疏水的核心，通過PM-LDL融合或交換介導的直接探針轉移是高度可行的。或者，表面活性劑PM聚合物可能摻入LDL中，形成攜帶熒光探針的新復合物。理論上，血細胞膜等兩親性生物組分也可能誘導熒光轉移。然而，之前在PM注射后的體內追蹤顯示熒光轉移極少，這表明它們在此過程中作用不大。在沒有直接PEG定量技術的情況下，觀察到的現象暫時歸因于PM聚合物向LDL的交換。然而，要證實這一假設，需要建立一種可靠的PEG定量方法。在此假設吸收復合物（ACQ）同時指示了PM解離和PM-生物相互作用。回收的PMs的粒度分析顯示，其直徑約為20納米，與PBS對照組相當（圖2C）。這些峰值信號始終高于“血清空白"的信號，后者是通過相同方法分離用作對照的。這表明血清孵育并未顯著改變PM的基本結構。

由于對聚合物-脂蛋白相互作用的理解有限，膠束的完整性在特定范圍內表達。保守估計，稱為Cmin，代表通過DGUC分離的PM帶熒光定量得到的完整PM的最小估計值。相反，上限估計，稱為Cmax，通過結合PM帶和“非PM"帶（與PM結構相似的結構）熒光，從總血清熒光變化中得出完整PM的估計值。這一范圍表達考慮了相互作用過程中物質轉移確切性質目前的不確定性。基于校準曲線（圖2D），通過在不同介質中建立顆粒結合熒光強度與顆粒濃度（以構成聚合物濃度表示）之間的線性關系，實現了半定量分析。根據校準曲線，聚合物濃度的檢測限（LOQ）確定為0.5 mg/mL。近紅外二區（NIR-II）成像證實，基質效應對該值的影響可忽略不計。檢測限（LOD）為0.25 mg/mL，熒光信號比背景高5倍。該方法具有穩健性，具有良好的回歸準確性和重復性。計算血清中PM的穩定性，結果如圖2E所示。僅血清稀釋不會自發損害PM的穩定性，最初保持>97%的完整性。然而，PM隨時間逐漸分解，1小時時保持>90%的完整性，8小時后保持65%-90%的完整性。總體而言，盡管血清成分導致緩慢降解，但PM在較長時間內保持結構完整性。新熒光信號在低密度脂蛋白（LDL）層內的共定位表明脂蛋白是PM穩定性的主要調節劑。本研究證實了脂蛋白與PM之間的特異性相互作用，導致復合物保持原始PM熒光。然而，這些相互作用在多大程度上從根本上損害了PM本身的結構穩定性，尚需進一步研究。研究者推測，更高的負載可能會導致更多的探針猝滅或探針轉移到LDL，但PM的穩定性不會低于基于該負載計算的結果。

圖3. PMs體內穩定性研究

利用近紅外二區（NIR-II）成像技術的優勢，直接在原位觀察了完整顆粒物質（PMs）在血管和器官內的分布情況。選擇小鼠是因為其皮膚層較薄，更有利于在線血管可視化。與完整顆粒物質相對應的熒光信號在血流中循環了較長時間（圖3A）。隨著血管熒光的逐漸減弱，肝臟熒光強度逐漸增加，表明顆粒物質在肝臟中積累。基于NIR-II的體內成像技術的高分辨率使得原位血管熒光與離體血液熒光測量之間呈現出強烈的線性相關性。

即使在長時間循環后，仍能從血清中成功回收代表完整PMs的熒光帶（圖3B）。粒徑分析（圖3C）顯示，注射后8小時，有一部分顆粒膜保持了其原始粒徑（約20納米），盡管有少數顆粒的粒徑超過了1000納米。與采用相同方法處理的“空白血清"相比，顆粒膜在全身循環后出現了一個新的峰（>1000納米），認為這是由于PMs發生了聚集。有趣的是，與體外血清孵育后回收的顆粒膜不同，體內分離的PMs在全身循環過程中表現出向更高密度的輕微偏移（圖3D）。推測這種密度變化是由于聚合物濃度降低，同時蛋白質更多地插入到膠束結構中，形成了混合膠束復合物，這些復合物在保持粒徑的同時改變了密度。

雖然簡單的血清稀釋對PM的穩定性影響甚微，但同時暴露于高剪切力下可能會加劇顆粒的破壞。比較靜態（體外，圖2B）與動態（體內，圖3D）條件下的熒光分布特征表明，剪切力會略微加速PM的劣化。要進一步驗證假設，需要使用微流控或受控剪切力孵育系統等方法。事實上，先前的研究已證明，在體外模擬裝置中，血液剪切力、與血細胞的碰撞以及與毛細血管壁的沖擊都會加速PM的破壞。如前所述，PM的完整性在特定范圍內表達。圖3E顯示，在全身循環1小時和4小時后，分別有79%-93%和54%-75%的PM保持結構完整性。值得注意的是，這一穩定性超過了報道值，在等效聚合物劑量下，1小時后僅約25%的完整顆粒殘留。與其長期循環特性一致，即使在16小時后，仍有12%-35%的完整PM存在于血液中（圖3E）。必須強調的是，該方法的局限性在于，所測量的循環中完整PM的減少代表了它們從血流中物理清除和結構解體的綜合效應。本文的方法對總剩余完整PM進行了半定量分析，但未區分這兩個過程的各自貢獻。未對PM的穩定性進行劑量依賴性評估。此外，由于基于吸收對比（ACQ）的成像是在1300 nm以上進行的，因此使用較低的聚合物濃度可能會顯著降低信噪比，從而可能影響半定量結果的準確性。

圖4. 通過瓊脂糖凝膠電泳（GEL）方法驗證PM的完整性

為了驗證分離過程本身對PMs穩定性沒有顯著影響，研究者采用了瓊脂糖凝膠電泳法理論上，帶負電荷的蛋白質在電泳過程中會向陽極遷移，而中性顆粒物質則大部分保留在加樣孔中，或因電滲作用而表現出輕微的陰極漂移（圖4A）。蘇丹黑染色證實了高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）蛋白質在凝膠上的遷移（圖4B），且顆粒物質在電泳緩沖液中表現出穩定性。通過建立總保留熒光強度與聚合物濃度之間的線性關系，實現了加樣孔中顆粒物質的半定量分析（圖4C）。在三個選定時間點，與血清體外孵育的顆粒物質計算出的穩定性值在凝膠電泳法和DGUC法之間沒有顯著差異（圖4D）。同樣，通過凝膠電泳法獲得的體內顆粒穩定性結果在不同循環時間下與DGUC數據一致（圖4E）。這些在不同分離技術下的一致發現強烈表明，本文的分離方法對顆粒物質穩定性影響微乎其微。因此，凝膠電泳法為血清樣本中顆粒物質的回收和評估提供了一種便捷的替代方法。

圖5. 從血清中回收的PMs的形態學表征

使用透射電子顯微鏡（TEM）檢查了從孵育混合物和血液樣本中回收的PMs的形態。本研究通過在1小時和4小時孵育后對血清孵育物進行密度梯度超離心（DGUC）以及在注射后1小時和4小時收集的血清樣本，成功地從生物樣本中分離出顆粒物質，以空白血清和PBS處理的顆粒物質作為對照，通過TEM對回收的顆粒物質進行直接形態學觀察。

收集的PM層通過分子排阻色譜法，使用G15葡聚糖凝膠柱進行脫鹽處理（圖5A）。對包括超濾和透析在內的脫鹽方法進行比較評估，證實分子排阻色譜法能夠很好地保持顆粒物質的完整性。回收顆粒物質的形態和粒度分布特征如圖5B所示。為評估處理效果，將PBS分散的顆粒物質進行了相同的操作程序。這些對照顆粒物質盡管名義粒度增加了約30 nm，但保持了均勻的粒度分布，實際變化保持在10 nm以下，多分散指數（PDI）從0.21略微增加到0.35。透射電子顯微鏡（TEM）觀察結果的驗證包括計數100個顆粒并繪制粒度分布圖，以區分顆粒物質與內源性血清成分（圖5B和C）。對照空白血清顯示寬泛的粒度分布，在20至60 nm之間沒有明顯的峰值。血清回收顆粒物質與PBS回收顆粒物質的粒度分布高度一致，證實圖4B中的大多數顆粒為顆粒物質而非內源性成分。TEM分析進一步表明，生物樣本回收的顆粒物質保持了其球形形態，粒度沒有顯著變化。

圖6. 脂蛋白通過在動態平衡中捕獲聚合物，緩慢破壞PM結構

在與包括人血清白蛋白（HSA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、脂蛋白（Lipo，HDL和LDL的混合物）、脂蛋白缺乏血清（-Lipo）和載脂蛋白（Apo）在內的多種蛋白質進行4小時體外孵育后，評估了PMs的穩定性。由于極低密度脂蛋白和膽固醇脂質微粒在脫鹽透析步驟中不穩定且易沉淀，因此未將其納入考慮范圍。除HSA外，所有蛋白質均從大鼠血清中提取。瓊脂糖電泳將顆粒物質與蛋白質混合物分離，從而能夠計算各組分對顆粒穩定性的特定影響（圖6A，左）。HSA和-Lipo在共孵育后未表現出結構影響，超過90%的顆粒保持完整。脂蛋白誘導的不穩定性反映了全血清的影響，凝膠孔中約有75%的顆粒保持完整。雖然單獨的HDL不會引起不穩定，單獨的LDL僅引起15%的結構損傷，但脂蛋白中兩種成分的共同存在可能產生了協同破壞作用。單獨的載脂蛋白未表現出穩定性影響，這表明脂蛋白中的脂質成分是關鍵的相互作用因素。這些發現通過動態凝膠滲透色譜（DGUC）（圖6A，右）得到了進一步驗證，盡管該方法復雜且時間有限，但DGUC證實了脂蛋白特異性引起的穩定性衰減趨勢是一致的。

脂蛋白和PMs均表現出具有磷脂和載脂蛋白的顆粒結構，這些磷脂和載脂蛋白具有與共聚物相似的兩親性特征。脂蛋白衍生的脂質可能會破壞共聚物鏈，而兩親性共聚物則可能相互摻入到結構兼容的脂蛋白中。由于生物組分檢測的限制，直接評估聚合物在血清蛋白中的分布具有挑戰性。熒光標記策略可能會改變結合親和力，因此采用無標記表面等離子體共振（SPR）檢測來評估聚合物-蛋白質相互作用。該方法將血清中含量蛋白質固定在傳感器芯片上，然后進行受控的聚合物引入和分離監測（圖6B）。將不同聚合物濃度的PMs加載到傳感器表面進行結合分析，隨后通過緩沖液洗滌進行解離。不同蛋白質的結合曲線如圖6C所示。HSA與PMs的結合未顯示出明顯的結合信號，表明結合和分離動力學迅速。響應信號在緩沖液洗脫后恢復到基線水平。相比之下，兩種脂蛋白均表現出明顯的結合趨勢，其特征是結合和分離緩慢。此外，緩沖液洗滌未能洗脫結合的分析物，由于聚合物與芯片之間的非特異性結合，留下了殘留信號。圖6D展示了通過親和力分析得出的平衡解離常數（KD）。HDL和LDL的KD值與HSA相比相差一個數量級以上。具體而言，HSA的KD值在低微摩爾范圍內（10?4–10?6 M），而兩種脂蛋白均表現出納摩爾級的親和力（10?7–10?9 M），表明它們與聚合物的相互作用更強。盡管已知HDL比LDL組裝得更緊密，對PMs的破壞作用較小，但在SPR實驗中觀察到的相似KD表明，芯片固定的HDL可能發生結構改變，導致組裝更松散，從而模擬LDL的結合行為。

這種親和力趨勢與上一節中的結構發現相一致：脂蛋白部分破壞了PM結構，而白蛋白盡管在血清中含量豐富，但對膜磷脂穩定性影響甚微。脂蛋白的高親和力和穩定結合可能使其能夠在動態平衡中螯合聚合物。這支持了本文的假設，即材料轉移導致了在低密度脂蛋白（LDL）層中觀察到的新熒光帶。

總之，本文成功建立了一種DGUC方法，用于從生物樣本中分離和回收PMs，顯著提升了研究者對它們在體外和體內穩定性的理解。該方法通過基于瓊脂糖凝膠電泳（其基于不同的分離原理）相互驗證了其可靠性。在近紅外二區（NIR-II）利用基于吖啶橙（ACQ）的成像技術，能夠直接觀察并更精確地量化顆粒的完整性。研究結果表明，PMs在血清和全身循環中長時間保持穩定的顆粒狀結構。它們可能通過聚合物被提取到脂蛋白的脂質核心中而逐漸被脂蛋白破壞。完整的PMs可以在血液中循環至少16小時，其中12%至35%的結構保持完整。脂蛋白，特別是低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），被確定為影響顆粒結構的成分。研究者提出，由于聚合物與脂蛋白的高結合親和力，當聚合物被提取到脂蛋白脂質結構中時，PMs結構的動態平衡可能會逐漸被破壞。然而，仍需借助*的檢測工具來驗證聚合物在不同蛋白質中的分布情況。研究還揭示了PMs在全身循環過程中密度的時變特征，這表明它們可能與膠束結構內的內源性成分發生交換過程。未來工作的目標是闡明在蛋白質相互作用過程中，剩余聚合物微粒的結構轉變。此外，本研究為探究載藥PMs的穩定性和釋放動力學建立了基礎框架。關鍵的下一步是評估藥物包封對PMs穩定性和生物相互作用的影響。本文確定的脂蛋白驅動的解聚機制為體內藥物釋放提供了一種合理的解釋。因此，脂蛋白與載藥PMs系統（如Genexol-PM®）的釋放特性之間的關系值得進一步深入研究。

參考文獻

Zhang, Zichen, et al. "In vivo stability of polymeric micelles revealed by analysis of intact nanocarriers." Journal of Controlled Release (2025): 114384.