流式實驗對照組設置指南！

引言

大家都知道在所有實驗中，都必須設置對照組，在類似WB、ELISA等實驗設置對照組相對簡單，主要目的是比較處理和未處理組的差異、證明處理有效等作用。但在流式細胞術實驗中，設置對照組的目的除了證明處理有效，更重要的是需要通過設置合理對照，定義什么是信號、什么是噪音，流式實驗中設置正確的對照組是獲得可靠數據、區分特異性信號與背景噪音的關鍵。接下來我們來了解下流式實驗中常見的對照類型及作用。

Section 01 — 空白對照

空白對照最基礎、最常見的對照，是指未經任何熒光染色的細胞樣本。空白對照的作用是：

1. 調節儀器電壓：用于確定細胞的基礎信號水平（即自發熒光），幫助將儀器各通道的電壓設置在合理范圍，避免信號"壓線"；

2. 界定陰性細胞群：在FSC/SSC散點圖上圈定目標細胞群，并作為后續判斷陽性的基礎參照。

Section 02 — 補償（單染）對照

在多色流式實驗中，由于不同熒光染料的發射光譜會重疊，必須進行熒光補償校準，這就需要單染對照。單染對照即分別只染一種抗體的樣本，有多少色的流式抗體就要做多少個單染對照。單染對照作用是：

.用于計算每個熒光染料滲漏到其他通道的比例；

.通過軟件去除光譜重疊，校準熒光光譜重疊；

.確保每個通道檢測到的都是"專屬"信號。

?? 提示：當目標抗原表達較弱時，可使用補償微球替代細胞來制備單染對照。

Section 03 — FMO 對照

FMO對照即少一個熒光通道的染色管（fluorescence minus one），需要這種對照是因為在多色流式實驗中（尤其是大于4色的），即使其他熒光經過補償，其擴散誤差仍會提高陰性群的背景，FMO對照能反映這種"本底"，是設置陽性門最準確的方法，對弱陽性或連續表達的抗原尤為關鍵。

舉例：同時檢測CD45RA和其他標志物時，若特別關注CD45RA表達情況，此時FMO對照指不加CD45RA流式抗體而其他流式抗體正常添加的對照，從而更顯著地體現CD45RA表達情況，提高數據可靠性和準確性。

Section 04 — 同型（Isotype）對照

同型對照是一種特殊的陰性對照，是指使用與實驗抗體同種屬來源、同亞型、同熒光標記，但又與樣本無特異性結合的抗體進行染色。這是為了排除樣本和流式抗體間非特異性結合（包括死細胞/碎片吸附、疏水/靜電結合、Fc受體結合等）而設置的，可以有效排除實驗過程中因非特異性結合導致的假陽性結果。

Section 05 — 生物學對照

這個實際上就是WB、ELISA等實驗中常見的對照組，例如已知陽性、已知陰性的樣本，與以上其他對照組相比，這類對照是其他樣本，而非實驗中本身需要檢測的樣本，其對照作用體現在確定實驗過程正常、處理和未處理樣本區別等。

總結

流式實驗中，對照組的合理設置尤為重要，合理的對照組設置可以有效避免假陽性、假陰性影響，保證結果準確、可靠和可重復性。

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