如何進行組蛋白 β-羥基丁酰化分析的樣品前處理？檢測技術服務詳情介紹

組蛋白 β-羥基丁酰化（β-hydroxybutyrylation, Kbhb）是一種新型賴氨酸翻譯后修飾，與代謝狀態密切相關，已被證實參與調控染色質結構與基因表達。組蛋白 β-羥基丁酰化修飾的豐度極低，且常與乙酰化、甲基化等其他修飾共存，極易被掩蓋。高效、專一的樣品前處理流程，是實現高靈敏度質譜檢測、jīngzhǔn修飾位點定位的前提。

一、 組蛋白 β-羥基丁酰化分析的標準樣品前處理流程

1、細胞/組織裂解與組蛋白提取

獲取高質量組蛋白的dìyī步是構建一個保護性裂解環境，尤其是針對組蛋白這種富含翻譯后修飾的dànbáizhì，裂解條件需盡量溫和，同時具備抑制去修飾酶活性的能力。細胞樣本如HEK293T、HeLa等常規貼壁系，建議在冷PBS中洗滌后，加入高濃度酸性緩沖液（如0.4 M HCl）直接裂解核結構。在裂解液中添加蛋白酶抑制劑和去乙酰化酶/去酰化酶抑制劑（如TSA、nicotinamide）是保留組蛋白 β-羥基丁酰化修飾的關鍵步驟。組織樣本可先使用組織研磨儀或勻漿器破碎，再采用酸性緩沖液提取。整個流程應始終保持低溫（4°C），并在旋轉條件下充分提取1小時以獲得盡可能多的組蛋白。隨后，通過三lǜyǐsuān（TCA）沉淀方式將dànbáizhì集中，再使用預冷丙酮清洗雜質與酸，zuì終獲得干凈的組蛋白沉淀。

2、組蛋白分離與純化

在分析如H3K9bhb、H4K12bhb等具體位點前，常需對組蛋白亞型進行分離純化。此步驟不僅提高分析分辨率，也有助于聚焦研究重點。實驗上常用兩種方法進行分離：一是SDS-PAGE，適用于小量樣品及特定組蛋白帶的切膠分析；二是反相高效液相色譜（RP-HPLC），適合大規模純化特定組蛋白，尤其是H3和H4。建議根據實驗目標選擇合適方式。若重點研究H3上的羥基丁酰化位點，可先利用HPLC收集高純度H3組分，再進入下一步酶解流程。

3、酶解

組蛋白結構的dútè性，使其在酶解中極易產生極短肽段，降低了質譜檢測的靈敏度與覆蓋率。yídànbáiméi雖為常規酶種，但單獨使用往往不理想。更有效的策略是使用組合酶解，例如yídànbáiméi聯合Lys-C，可在不犧牲識別位點數量的前提下獲得更適合質譜檢測的中等長度肽段；Glu-C亦是常用替代選擇，特別適合目標修飾位于gǔānsuān殘基附近時使用。建議控制酶解時間在4至16小時之間，采用兩階段酶解策略（先短時預酶解，后長時充分酶解）可獲得更穩定的結果。此外，酶解時的緩沖液條件（如pH、離子強度）也應根據酶種進行優化，避免失活。

4、β-羥基丁酰化修飾肽段富集

在未富集的肽段混合物中，β-羥基丁酰化肽僅占極小比例，幾乎無法直接在質譜中識別。目前zuì常用的是免疫親和富集法。該方法依賴高親和力的 pan-Kbhb 抗體，通過磁珠固定化操作選擇性結合修飾肽段。實驗中，將酶解后的肽段溶液與預活化抗體磁珠在4°C條件下旋轉孵育8-12小時，有助于達到飽和結合。洗脫過程同樣關鍵，建議使用含0.1%三fúyǐsuān（TFA）或0.2%甲酸（FA）的溶液，溫和釋放結合的修飾肽段，避免破壞結構或修飾。需要注意的是，抗體質量直接決定富集效率與特異性。

5、脫鹽純化與質譜上樣

富集后的肽段需經過C18固相萃取小柱進行脫鹽處理，以去除緩沖鹽離子和干擾物質，確保進入質譜系統后不會造成離子抑制或電噴霧效率下降。推薦流程包括以下步驟：先用高濃度有機溶劑（如50%乙腈）活化小柱，再用0.1%甲酸平衡；樣品加載后，使用低強度洗液清除雜質；zuì后用80%乙腈+0.1%甲酸溶液洗脫目標肽段。洗脫液應經SpeedVac濃縮至干，再重懸于0.1%甲酸緩沖液中，即可用于LC-MS/MS分析。為了確保數據的一致性與可比較性，建議在每批樣品中加入內標肽段進行質量監控，尤其在開展多條件比較實驗（如處理組 vs.對照組）時尤為必要。

雖然組蛋白 β-羥基丁酰化的研究仍屬新興領域，但通過上述高標準的樣品前處理流程，科研人員可獲得更穩定、更高質量的質譜原始數據。在實際項目中，百泰派克生物科技也積累了針對Kbhb修飾的標準化操作方案與抗體篩選經驗，助力科研客戶從樣本到數據再到機制解析，全流程無憂。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統對dànbáizhì序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、蛋白zhìzǔxué

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量蛋白zhìzǔxué、bǎxiàngdàn白zhìzǔxué、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種蛋白zhìzǔxué分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白zhìzǔxué服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規模實驗分析，發現新的生物標記物;

2.體內體外多種dànbáizhì標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學分析，分析更系統準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，zuì后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優勢：

1.技術先進，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現了數量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從zuì小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列wánshàn的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產品變異性和純度分析。旨在提供優質生物藥物分析服務，幫助生物醫藥生產商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，zhuānyè提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白zhìzǔxué、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優質的生物質譜分析服務!

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