G.分離肌紅蛋白用于體外研究

原則：

純化肌紅蛋白有時是必要的，例如用于比較 不同物種肌紅蛋白（Mb）的自氧化速率。肌紅蛋白（分子量約16,949）可以從骨骼肌或心肌中輕松純化 。

其紅色便于在層析過程中直觀觀察。該方法使用相對廉價的設(shè)備即可獲得較高產(chǎn)率的肌紅蛋白（Faustman和Phillips，2001；改編自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。

樣品、試劑和溶液

1. 去脂去筋的牛肉塊

2. 均質(zhì)化緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C 

3. *

4. 硫酸銨

5. 透析緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C 

6. 色譜洗脫緩沖液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C 

記下

為了抑制/減少亞鐵肌紅蛋白的形成，均質(zhì)化和所有后續(xù)步驟應(yīng)在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下進(jìn)行。

設(shè)備

攪拌器、紗布、4℃ 下 20,000×g 轉(zhuǎn)速離心機(jī)、透析管（分子量截留值12，000至14，000）、Sephracryl S-200HR色譜柱（30×2.5至cm）、蠕動泵。需要額外試劑和設(shè)備來測定蛋白質(zhì)濃度，或 基于其消光系數(shù)計(jì)算肌紅蛋白濃度 。

制備勻漿

1. 將150克切碎的肌肉與450毫升勻漿緩沖液放入攪拌機(jī)中進(jìn)行勻漿處理高速運(yùn)轉(zhuǎn)1至2分鐘。

2. 將勻漿液均等分裝至各試管中， 在4℃ 下以3000× g 離心10分鐘。

3. 棄去池上清液， 用* 調(diào)節(jié)所得上清液的pH至8.0。

4. 用兩層紗布過濾上清液，以去除脂質(zhì)和結(jié)締組織顆粒。

沉淀肌紅蛋白

1. 將濾液飽和至70%硫酸銨濃度（472克硫酸銨/升濾液），用*調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌1小時。

2. 將勻漿液均等分裝至各試管中，4℃條件下以18,000× g 離心20分鐘，去除沉淀蛋白。

3. 合并上清液，棄去沉淀。

4. 將上清液從70%濃度調(diào)整至100%硫酸銨飽和度（通過添加上清液中額外添加228克硫酸銨/L），用*調(diào)節(jié)pH至8.0， 并攪拌1小時 。

5. 將勻漿液均分至各試管中，隨后以1000×g離心1小時。20,000 × g ，4 ° C。棄去上清液，加入1或2 mL冰冷卻緩沖液以幫助沉淀物的回收。

透析和純化肌紅蛋白

1. 將沉淀的肌紅蛋白轉(zhuǎn)移至透析管中，并在4 ° C下使用透析緩沖液（1體積蛋白質(zhì)，10體積緩沖液）透析24小時，每8小時更換緩沖液。

2. 使用蠕動泵 ，用色譜洗脫 緩沖液（3個色譜柱體積）平衡Sephacryl S-200 HR色譜柱。

3. 將透析液加入色譜柱，以60mL/小時的流速用色譜洗脫緩沖液洗脫肌紅蛋白提取物。該步驟將血紅蛋白與肌紅蛋白分離。血紅蛋白將首先洗脫為淡紅色/棕色條帶。肌紅蛋白隨后作為 明顯可見的深紅色條帶洗脫。

4. 使用分餾收集器收集含肌紅蛋白的餾分。

肌紅蛋白濃縮物

1. 將所有含肌紅蛋白的組分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳法可評估肌紅蛋白提取物的純度，該提取物應(yīng)產(chǎn)生一條分子量為17kDa的單一蛋白條帶 。

2. 使用離心濃縮器濃縮肌紅蛋白溶液。

3. 或者（步驟2的替代方案），將肌紅蛋白溶液飽和至100%硫酸銨濃度（761克硫酸銨/升溶液），將pH調(diào)節(jié)至8.0，攪拌溶液1小時。

將溶液均分至各試管中，并在4°C下以20,000×g離心1小時000×gg。排棄上清液，并按前述方法透析肌紅蛋白 。

4. 或者（步驟2和3），肌紅蛋白可通過 Trout和Gutzke（1996）所述 的超濾法濃縮。

5. 測定肌紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度，并分裝至 -80℃ 冷凍保存。

記下

這種肌紅蛋白分離程序的產(chǎn)量相對較低，需要2到3個月的收集才能得到大量的肌紅蛋白。

參考文獻(xiàn)

Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測量. 《食品分析化學(xué)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。

特勞特，G.R.和D.A.古茲克。1996年。一種簡單、快速的制備方法，用于分離和純化氧肌紅蛋白。肉類科學(xué)43 ：1- 13 。

Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌紅蛋白的制備. Methods Enzymol. 76 ：29–42.

H.從牛骨骼肌中分離線粒體

原則

線粒體分離包含三個步驟：細(xì)胞裂解、勻漿和離心。使用蛋白酶處理骨骼肌可顯著促進(jìn)線粒體釋放，同時提高產(chǎn)量。

試劑

1. 1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1 L蒸餾水中，混勻，分裝成20 mL等分試樣， 于-20℃ 保存。

2. 0.1M Tris/MOPS：將12.1克Tris[三（羥甲基）氨基甲烷]溶解于500mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 至7 。使用MOPS[3-（N-嗎啉代）丙磺酸]粉末，將溶液定容至1L，并于4°C保存。

3. 1 M Tris/鹽酸：將121.14 g Tris溶于500 mL蒸餾水中， 用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4 ， 將溶液稀釋至1 L并室溫保存 。

4. 1 M EDTA：將372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸餾水中，并于4℃保存 。

5. 10% BSA：將10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸餾水中， 存放于-20℃ 。

7. 10mMEDTA：將2.92gEDTA溶于1L蒸餾水中，并于4℃ 保存 。

8. 0.5%BSA：將5 g BSA溶于1 L蒸餾水中，并于-20 °C 下保存。

9. 納加酶：配制20毫克/100毫升分離液濃度的納加酶溶液（即20毫克/100毫升）。重要提示：其他蛋白酶（胰蛋白酶）的選擇取決于研究者偏好和方案，以及用于分離線粒體的肌肉類型。

關(guān)鍵步驟3： 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備所有緩沖液，以避免儲存的緩沖液中細(xì)菌/酵母生長。

關(guān)鍵步驟4： 由于pH值取決于溫度，所有溶液的pH值都應(yīng)在25°C時測量。

操作步驟

1. 取5克（精確至0.1克）目標(biāo)肌肉組織樣本，確保不含可見脂肪或結(jié)締組織，隨后切成小塊。

2. 取小燒杯，將肌肉組織浸入20毫升冰浴PBS（磷酸鹽緩沖液）中，其中添加了10 mM EDTA。

3. 用剪刀把肌肉切成小塊。

4. 用含10 mM EDTA的冰凍PBS緩沖液對碎肌肉進(jìn)行2-3次清洗。

5. 將切碎的肌肉重新懸浮于5毫升冰凍的含10 mM EDTA的PBS溶液中。

6. 以200 × g 離心5分鐘，棄去上清液。

重要提示： 組織與分離緩沖液的優(yōu)化比例范圍1：5 至1：10（w/v）。

8. 使用以1600rpm轉(zhuǎn)速運(yùn)行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均質(zhì)化肌肉組織；將均質(zhì)化的肌肉搗碎10至20次 。

重要提示： 在開始實(shí)驗(yàn)前5分鐘將玻璃器皿置于冰浴中預(yù)冷。勻漿及后續(xù)步驟必須在4 ℃下進(jìn)行，以盡量減少磷脂酶和蛋白酶的激活，從而避免對肌肉造成損傷。

9. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 離心 10分鐘 。

10. 將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中， 4℃ 以8000× g 離心10分鐘。

14. 使用Biuret/Bradford法中的一種方法測定線粒體濃度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。

參考文獻(xiàn)

Bhattacharya，S. K.，J. H. Thakar，P. L. Johnson和D. R. Shanklin. 1991.使用含有EDTA和Nagarse的離子介質(zhì)從倉鼠中分離骨骼肌線粒體。分析生物化學(xué)192： 344 — 349 。

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i. 完整肌肉或絞肉的耗氧量

原則

新鮮切割的肉片需經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的氧氣處理（即讓其充分氧化），隨后進(jìn)行真空包裝。通過酶呼吸作用導(dǎo)致的氧化肌肉組織（OMb）減少量，可作為衡量組織氧氣消耗能力的指標(biāo)。在25℃水浴或培養(yǎng)箱中，立即記錄400-700納米波長范圍內(nèi)的反射光譜，并在20分鐘后再次測量。

氧化肌紅蛋白水平通過K/S轉(zhuǎn)換公式計(jì)算得出，具體方法詳見第九節(jié)。K/S610/K/S525比值越高，表明OMb含量越高。氧氣消耗量（OC）以基于起始值與最終值的百分比變化形式呈現(xiàn)。

設(shè)備和用品

1. 真空包裝機(jī)

2. 聚氯乙烯薄膜

4. 能掃描并記錄400至700 nm表面反射率的分光光度計(jì)（見 第IX節(jié)）

操作步驟

1. 例如，所有待測樣品必須處于相同溫度（4 ° C）下，否則溫度越高，樣本的耗氧量越快，而藻華發(fā)育（即富氧）則越慢；溫度越低，耗氧量越慢，藻華發(fā)育則越快。

2. 為確保氧氣供應(yīng)均勻，所有樣本需保存在 2-4℃ 的環(huán)境中。對于完整肌肉樣本，應(yīng)用鋒利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的樣本塊，盡量去除可見脂肪和結(jié)締組織。

研磨樣本則需準(zhǔn)備體積相當(dāng)?shù)木鶆驂簩?shí)立方體，其可見脂肪含量應(yīng)與樣本瘦肉部分的典型水平相當(dāng)。切記使用鈍刀具，以免破壞表面結(jié)構(gòu)。同時避免對研磨樣本的表面進(jìn)行過度操作或擠壓（參見Madhavi和Carpenter，1993年研究）。

3. 如果表面不是新鮮的切割面，那么在開始開花步驟之前， 只需去除一層薄薄的表面層，以暴露新鮮的組織 。

4. 用一小塊透氣膜覆蓋新切面，防止干燥。將聚氯乙烯膜（常用）平鋪一層，確保表面均勻接觸空氣。記錄膜的透氣性。

5. 在2至4°C（或其他標(biāo)準(zhǔn)時間）下進(jìn)行2小時的顯色。注意使所有樣品在該步驟中保持相同的溫度，因?yàn)轱@色非常依賴于溫度。

6. 花開后，去除聚氯乙烯薄膜并將樣品放入氧氣滲透性極低的袋中。用高真空快速真空包裝；保持樣品間的真空均勻。

7. 立即掃描樣品表面，以測定400至700nm范圍內(nèi)的反射率，從而確定初始OMb 。 光譜儀必須通過真空袋薄膜進(jìn)行校準(zhǔn)。

8. 為加快氧氣消耗，使用25 ° C的培養(yǎng)箱或水浴。20分鐘后（或根據(jù)所用肉類的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)時間）重新掃描同一表面。

計(jì)算

%OMb=[K/S610÷K/S525（100%DMb）]-[K/S610÷K/S525（樣品）]÷[K/S610÷ K/S525（100% DMb）]-[K/S610÷ K/S525（100%OMb）][×100]。

氧消耗量=[（初始OMb%?最終OMb%）÷初始OMb%]×100。

記下

馬達(dá)維和卡彭特（1993年）提出了一種利用反射光譜儀測量氧氣消耗量（OC）的檢測方法。該方法通過配備反射光譜附件的分光光度計(jì)，首先對真空包裝樣品的表面有機(jī)物（OMb）含量進(jìn)行測定，并以5分鐘為間隔（總計(jì)20分鐘）在4℃條件下重復(fù)測量。 

樣品尺寸經(jīng)過調(diào)整（2.5×2.5×0.5厘米）以適應(yīng)反射光譜儀的樣品接口。有機(jī)物的相對濃度采用克日維茨基（1979年）的方法計(jì)算，但唐等人（2004年）對其進(jìn)行了改進(jìn)，并推薦了 修訂后的波長參數(shù)（詳見第九節(jié)）。氧氣消耗量以百分比形式表示 ，即真空包裝樣品在10分鐘內(nèi)消耗的初始表面有機(jī)物量 。

Mancini、Hunt和Kropf（2003）報告了一種使用610nm反射率直接測定OMb的方法。這是可能的，因?yàn)镺Mb在610nm處具有其獨(dú)特的反射率，而610nm 對DMb和MMb都是等滲的（關(guān)于肉表面反射率測量和 K/S 比率 的進(jìn)一步討論，參見第IX節(jié)）。該方法已成功使用（參見King等人，2011）。

部分研究采用單位時間內(nèi)有機(jī)物（OMb）百分比變化值來報告實(shí)際“耗氧量"，但這種方法操作繁瑣且耗時。對于大量樣本，通常將“耗氧量"計(jì)算為樣本初始有機(jī)物含量的“平均百分比降幅"。 樣本脫氧時間需標(biāo)準(zhǔn)化 ， 通常 20分鐘即可檢測出樣本差異 。

參考文獻(xiàn)

King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測量時間對肌紅蛋白還原活性和耗氧量與長肌肉色穩(wěn)定性儀器測量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。

Madhavi，D.L.和C.E.Carpenter.1993.衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J.Food Sci.58：939—942。

曼奇尼，R.A.，M.C.亨特，和D.H.克羅普.2003.610納米反射率估計(jì)牛肉表面的氧合血紅蛋白含量.Meat Sci.64：157—162.

 Mohan，A.，M.C.Hunt，T.J.Barstow，T.A.Houser和DM.Hueber. 2010a. 通過近紅外血氧測定法檢測三種后強(qiáng)直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem.123：456—464。

唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格蘭。2004年。重新審視克日維茨基，水性肉類提取物中肌紅蛋白氧化還原形式分光光度測定的方程式。食品科學(xué)雜志69： C717 — C720 。

J.完整肉或碎肉的肌紅蛋白還原能力

原則

首先將樣本切片浸入稀硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使表面色素氧化生成甲基甲基藍(lán)（MMb） 。隨后將切片（厚度1.27厘米）真空包裝，在30℃環(huán)境下通過測量 K/S比值（572/525納米波長）持續(xù)監(jiān)測表面MMb含量2小時。樣品的還原能力定義為培養(yǎng)期間表面MMb濃度的百分比降幅。MMb濃度的下降程度可視為組織還原鐵血紅素鐵 能力的反映。

試劑

1. 0.3%（w/w）亞硝酸鈉溶液：稱取大燒杯，稱取3.0g NaNO2加入燒杯中，加蒸餾水至1000克，每日新鮮配制，室溫孵育。

操作步驟

1. 取一塊3cm×3cm×2cm的肌肉組織樣本（無可見脂肪或結(jié)締組織），若使用絞肉則取一塊大小相近且緊密壓實(shí)的樣本，以防止樣本浸入時碎裂。

2. 務(wù)必先對樣本進(jìn)行定位，以便確定后續(xù)要評估的表面。該表面可能是新切面，也可能是展示過的表面。

3. 2 將樣品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室溫浸泡20分鐘以誘導(dǎo)MMb形成。研磨后的樣品可置于小篩網(wǎng)上，以幫助降低和提升立方體，同時盡量減少碎裂。

4. 從燒杯中取出樣品，用布擦去多余的溶液。 盡可能保留三維形狀，并將用于評價的表面放入 不透水的袋中并真空包裝（真空度均勻）。真空可能會稍微壓平或圓化樣品 。

5. 立即掃描400至700 nm的反射率，以確定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。

6. 將樣品置于30°C的培養(yǎng)箱中 ，2小時后重新掃描以測定MMb的剩余量。

計(jì)算

%MMb=[K/S572÷K/S525（100%DMb）]-[K/S572÷ K/S525（樣品）]÷[K/S572÷K/S525（100%DMb）]-[K/S572÷K/S525（100%MMb）][×100]。

MRA（MMb減少的百分比）=[（初始%MMb?最終%MMb）÷初始%MMb]×100 或?qū)⒊跏糓Mb作為MRA的指標(biāo)（見下文注釋）。

記下

部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亞硝酸鈉溶液中氧化反應(yīng)生成的MMb初始量可作為樣本 MRA 的良好指標(biāo)。但King等（2011）發(fā)現(xiàn)，MMb的還原百分比比其初始生成量更具參考價值。因此，建議同時采集并統(tǒng)計(jì)分析MMb的初始生成量及其在孵育過程中的還原百分比。

參考文獻(xiàn)

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