最大限度提高滴度的慢病毒載體生產可擴展解決方案 

無論您采用貼壁系統還是從事懸浮培養生產，病毒生產都會是您整體運營過程中價格不菲的一環。我們的目標是最大限度提高滴度，為您的病毒生產提供高性價比的可擴展解決方案。 

我們致力于助力客戶取得商業化成功，這也是我們不斷開發新的解決方案，不斷幫助您走在細胞和基因治療的根本原因。 

賽默飛提供慢病毒載體相關產品，請訪問獲取產品最新信息。 

針對懸浮培養慢病毒生產進行了優化 

· Gibco LV-MAX 慢病毒生產體系 

· 高滴度—超過1 x 108 TU/mL （未濃縮的LVVs-GFP） 

· 可擴展的懸浮培養體系—規格可從96孔深孔板擴展到2L生物反應器 

· 無血清—消除了動物源成份及相關的風險 

· GMP積極開發計劃 

Gibco LV-MAX 慢病毒生產體系是針對化學成分明確的無血清環境下的懸浮培養慢病毒生產進行過優化，包含最大限度提高生產所需的所有高質量成份的系統。? 

為改進慢病毒生產而優化的多成份體系 

LV-MAX 慢病毒生產體系可提供可擴展、高產量的慢病毒載體生產平臺。其基于在LV-MAX生產培養基中培養的HEK 293來源的病毒生產細胞高密度培養物。通過我們先進的脂質體納米微粒 轉染試劑結合新型的慢病毒特異性增強劑和添加劑（圖1），調控實現最佳的慢病毒滴滴度。所有成份協同作用，相對于傳統的聚乙烯亞胺(PEI)血清培養體系，有助于生成更優良的功能性慢病毒微粒（圖2）。上述數據證明，相對于使用未經優化的系統，我們的完整體系在提高慢病毒載體(LVV)方面的突出積極影響（圖3）。 

圖 1.LV-MAX 慢病毒生產體系實驗方案概覽 

圖 2：采用LV-MAX體系的病毒滴度顯著提高采用我們的LV-MAX慢病毒生產體系或替代轉染試劑和細胞，在30 mL搖瓶之中生產慢病毒。LV293 = Gibco 病毒生產細胞（HEK 293來源的懸浮細胞），293F = Gibco FreeStyle 293-F細胞系，PEI = 聚乙烯亞胺。 

以更低的成本實現更高產量的慢病毒生產 

相對于基于PEI的系統，LV-MAX體系的貼壁細胞慢病毒產量提高近15倍，懸浮細胞慢病毒產量提高近10倍，且成本下降了50%以上。 

圖 3.采用LV-MAX慢病毒生產體系，慢病毒產量大幅提升。采用LV-MAX慢病毒生產體系的懸浮細胞慢病毒產量（未過濾）與采用PEI介導的慢病毒載體轉染方法的貼壁HEK 293T/FT 細胞和懸浮HEK293細胞慢病毒產量比較。通過轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞進行慢病毒滴度測定。同時展示了帶來的成本節省情況。 

更自信地規模化擴展 

LV-MAX慢病毒生產體系支持在不同的懸浮培養皿中進行穩定的慢病毒生產。您可以根據自己在發現研究早期的需要擴大或縮小自己的規模以實現更高的通量，亦可在維持無血清體系高產量的前提下無縫、高效規模化擴展（圖4）。無論何種規模，您均可更自信地開展生產。 

圖 4.LV-MAX慢病毒生產體系在HEK 293來源的懸浮細胞之中的可擴展性。采用LV-MAX 慢病毒生產體系，通過96孔深孔板到2 L生物反應器，進行不同體積的慢病毒生產。通過轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞，測定慢病毒滴度；在不同體積規格下，觀測到了相似的滴度。 

可實現出色的貼壁培養慢病毒生產的先進脂質體納米微粒技術 

Invitrogen Lipofectamine 3000轉染試劑是高效、高性價比的慢病毒生產工具。即便是較大或難以包裝的基因，通過這種多功能試劑亦可實現高病毒滴度。 

Invitrogen Lipofectamine 3000試劑 

· 高滴度—涵蓋了較大或難以包裝的基因 

· 作用溫和—減少了試劑用量，提高了細胞活力 

· 靈活—與我們現有的實驗方案兼容 

· 性價比高—所需的輔助試劑和人力成本更少 

Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI的平行比較結果顯示，Lipofectamine 3000試劑介導的慢病毒生產產量相對于其他轉染試劑提高了約5–10倍（圖5）。 

圖 5.采用Lipofectamine 3000試劑進行的貼壁細胞慢病毒生產。分別將Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI加入到含HEK 293T/FT細胞的6孔培養板中，獲得pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和Invitrogen ViraPower慢病毒包裝混合物。轉導HT1080細胞并分析GFP陽性細胞，測定慢病毒滴度。 

病毒轉染原理及步驟 

對于不適合脂質體介導轉染的細胞類型，通常使用病毒載體進行轉染。病毒介導轉染也稱為轉導，這種轉染方式可在難以轉染的細胞類型中實現蛋白過表達或敲低，是臨床研究中的方法（Glover 等人，2005；Pfeifer 和 Verma，2001）。腺病毒、致癌逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞培養物和體內的基因遞送。病毒基因轉移的其他示例包括基于桿狀病毒和牛痘病毒的載體。有關各種病毒遞送系統的更多信息，請參見病毒載體。 

雖然病毒能整合到宿主基因組中，體內轉染效率高且能持續基因表達，因而成為臨床試驗中基因遞送的系統，但也存在許多缺點，包括其免疫原性和細胞毒性、載體方面存在技術挑戰且生產程序耗時費力、生物安全要求導致高成本、低包裝能力（大多數病毒載體約為 10 kb，而非病毒載體約為 100 kb）以及病毒載體制劑的感染性存在變異性（Glover 等人，2005；Kim 和 Eberwine，2010；Vorburger 和 Hunt，2002） 

典型的轉導方案涉及改造攜帶轉基因的重組病毒、在包裝細胞系中擴增重組病毒顆粒、純化和滴定擴增后的病毒顆粒以及隨后感染目標細胞。雖然在原代細胞和細胞系中實現的轉導效率相當高（約為 90%-100%），但只有攜帶病毒特異性受體的細胞才能被病毒感染。同樣重要的是應注意，用于病毒擴增的包裝細胞系需要用非病毒轉染方法轉染。 

病毒遞送操作流程 

步驟一：生成病毒 

通過基因克隆生成重組病毒。 

步驟二：非病毒轉染 

使用非病毒方法轉染包裝細胞系以擴增和分離病毒載體。 

步驟三：病毒純化 

純化并滴定含轉基因的病毒載體。 

步驟四：感染和病毒清除 

以適當的感染復數 (MOI) 感染目標細胞（含病毒特異性受體）。 

從培養物中去除病毒和/或加入新鮮培養基。 

步驟五：檢測細胞 

檢測轉導后細胞的基因表達或沉默情況。 

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