環境穩定性巡檢清單

培養箱每 24 h 記錄一次溫度與 CO? 濃度，允許誤差 ±0.2 °C 與 ±0.1 %。每月拆洗水盤并更換無菌去離子水，防止真菌揮發孢子落入培養皿。遇到斷電重啟，先將箱內溫度拉回 37 °C 再置入細胞，避免溫度沖擊造成端粒酶瞬時下調。

培養基防衰策略

FBS 批次差異是漂移的最大誘因。建立 3 批平行試養模型：新批次血清與舊批次按 1:1 混勻培養 3 代，測倍增時間、細胞直徑、IL-6 分泌量三項指標。任一指標波動超過 10 %，整批血清封存退貨。ITS-X、EGF 等添加因子開封后 4 °C 避光保存 30 天，過期直接丟棄，絕不延長使用。

支原體隱形污染排查

每月第一周執行“兩周雙檢"：第一周熒光法初篩，第二周 PCR 復核。出現可疑熒光點即刻啟動隔離流程，陽性皿封蓋后直接高壓滅活。環境對照皿同步培養，確認污染源來自細胞而非試劑或操作。污染史寫入批次履歷，方便后續回溯。

代數紅線管理

實驗室內部規定：P0–P30 為黃金期，P31–P50 為警戒期，P51 起進入淘汰池。警戒期每 3 代抽檢核型與端粒長度，發現非整倍體或端粒 <6 kb 立即降級為飼養層細胞使用，不再用于分子實驗。淘汰池細胞統一做支原體、核型、STR 終檢后封存，避免誤用。

凍存庫分級備份

液氮罐分 A、B、C 三區：A 區日常取用，B 區半年備份，C 區異地災備。每支凍存管貼二維碼，掃碼即可讀取復蘇日期、代數、操作人。A 區每支細胞限用 3 次，第 3 次后轉入 B 區封存。C 區每年更新一次，確保災難恢復能力。

復蘇后“慢啟動"協議

復蘇當天僅更換一次培養基，48 h 內不消化傳代，讓細胞從 DMSO 應激中恢復。第 3 天開始按 1:3 比例傳代，連續 3 代倍增時間穩定在 24 h 以內再進入正式實驗。復蘇后首代禁止做任何藥物處理，防止應激-藥物協同毒性導致功能缺失。

交叉污染防火墻

同一操作臺不允許多人同時處理不同細胞系。使用獨立移液器與吸頭盒，臺面 75 % 酒精擦拭后紫外照射 30 min。每月進行一次 STR 抽查，與入庫圖譜比對，任何位點差異 >1 個重復序列即啟動全庫排查。排查期間所有相關實驗暫停，直至污染源定位。

數據化保養日志

建立在線表單記錄每一次換液、傳代、凍存、復蘇的時間、代數、操作者、試劑批號。系統自動計算倍增時間與代數，提前 3 代郵件提醒進入警戒期。數據公開給全組，任何人都能實時查看細胞健康趨勢，減少人為記憶誤差。