基因背景與構建策略

SV40 大 T 抗原片段長度 2.7 kb，插入位點選在 AAVS1 安全港，利用 CRISPR/ Cas9 敲入后通過嘌呤霉素篩選。Cas9 表達框由 CAG 啟動子驅動，兩側配置 WPRE 與 bGH polyA，保證心肌細胞高轉錄活性下的持續表達。測序驗證顯示，Cas9 編碼區無點突變，插入純合率 > 98 %。

體外增殖與表型維持

倍增時間 28 ± 2 h，連續培養 50 代未見形態學漂移。肌節 α-actinin 呈典型橫紋排列，跳動頻率 55 ± 8 bpm，與新鮮分離的新生大鼠心肌細胞共測無差異。SV40 表達量隨代次上升，但 p53 通路保持沉默，說明永生化機制穩定。

Cas9 活性定量數據

• SpCas9 切割效率：針對 PCSK9 位點 T7E1 檢測 87 %

• 全基因組脫靶：GUIDE-seq 檢測 0 個高置信位點

• indel 精度：> 90 % 為 1 bp 插入，便于后續精確建模

電生理參數

凍存與復蘇規格

凍存密度 5 × 10^6 cells/mL，凍存液配方 90 % FBS + 10 % DMSO。復蘇后 24 h 貼壁率 ≥ 85 %，48 h 恢復同步跳動。每批次附帶液氮溫度記錄曲線，確保運輸全程低于 ?70 °C。

配套培養體系

• 基礎培養基：StemPro-34 SFM + 2 % B-27

• 抗生素：Primocin 100 μg/mL，抑制支原體而不干擾 Cas9 表達

• 基質涂層：0.1 % 明膠 + 5 μg/mL 纖維連接蛋白，48 h 內無需換液

質檢報告必須包含的項目

1. STR 圖譜與原始供體匹配度 100 %

2. 支原體 qPCR Ct ≥ 38

3. Cas9 Western blot 條帶單一，分子量 160 kDa

4. 心肌標志物 cTnI、Nkx2.5 免疫熒光雙陽性率 ≥ 95 %

常見實驗適配性

• 基因敲除：單 gRNA 文庫篩選，48 h 內完成 > 500 個位點

• 堿基編輯：與 ABEmax 共轉染，A-to-G 效率 72 %

• 電穿孔參數：1600 V, 10 ms, 3 pulses，細胞存活率 85 % 以上

安全與合規

SV40 序列不含復制起點，無法包裝成病毒。細胞攜帶的 Cas9 為核酸酶活性型，實驗室需按照 NIH rDNA 指南進行 BSL-2 管理。出口需提供 ECCN EAR99 聲明。