IFN-γ 在 4 h 內就會因為蛋白酶剪切丟掉 C 端 10 個氨基酸，信號從 900 pg/mL 掉到 500 pg/mL。下面把 Rat IFN-γ ELISA Kit 拆成 12 個動作，每一步給出秒表級時間點和可量化的質控點，照著跑能把板內 CV 壓到 4 % 以下。

1. 樣本離體 30 min 內完成預處理

大鼠尾靜脈取血 0.5 mL，室溫靜置 25 min 看到血邊緣收縮，立即 4 ℃ 3000 rpm 10 min。

質控：血清層出現“草莓奶蓋"狀溶血直接棄掉，游離血紅蛋白 450 nm 吸光度 >0.2 會拉高空白 OD。

2. 1:2 預稀釋用 kit 自帶 Sample Diluent，別用 PBS

PBS 缺蛋白酶抑制劑，IFN-γ 在 37 ℃ 每 10 min 降解 5 %。

正確動作：把 50 µL 血清加到 50 µL 藍色 Sample Diluent（含 1×Complete EDTA-free），渦旋 2 s，冰上靜置 5 min 再上板。

3. 標準品 7 點梯度：先加 225 µL 再倍比，不搞“反向稀釋"

反向稀釋（高濃度→低濃度）會把槍頭外壁 0.2 µL 殘液帶到下一孔，曲線前端上翹。

操作：

• 1.5 mL EP 管排 7 個，先每管加 225 µL Sample Diluent。

• 取 225 µL 2000 pg/mL 母液加入第 1 管，換槍頭混勻 5 次，再取 225 µL 到第 2 管，依次類推。

• 第 7 管直接當 0 點，不再額外稀釋，消除“空白污染"。

4. 預洗板 2 次，30 s/次，倒扣拍干 3 次

包被抗體在 4 ℃ 保存時會有少量 IgG 脫落。

參數：自動洗板機 350 µL/well，30 s 浸泡；手工洗 250 µL，同樣 30 s。倒扣在吸水紙拍 3 次，每拍一次旋轉 90°，殘留體積 <2 µL。

5. 加樣 100 µL，45° 貼壁，避免氣泡

IFN-γ 濃度 <10 pg/mL 時，氣泡邊緣蛋白吸附造成 0.01–0.02 OD 偏差。

手法：槍頭尖貼孔壁 45°，緩慢推至第 2 檔，回吸 2 µL 帶走氣泡。整板加完到封板膜 <3 min，防止蒸發邊緣效應。

6. 室溫孵育 2 h ± 5 min，用鋁箔全包裹

實驗室空調風直吹會使邊緣孔溫度低 1 ℃，反應速率慢 8 %。

解決：平板放在濕盒，蓋鋁箔，遠離空調出風口。手機設 120 min 倒計時，±5 min 內結束，保證批內 CV <4 %。

7. 洗板 5 次，最后一次浸泡 60 s

IFN-γ 檢測抗體為兔多抗，非特異結合比單抗高。

設置：自動洗板機程序 5 循環，末次浸泡 60 s，把游離 IgG 拉到本底以下。手工洗板時用力過猛會刮包被，沖洗高度保持 5 mm。

8. HRP-鏈霉親和素 100 µL，22 ℃ 45 min

鏈霉親和素在 37 ℃ 易聚合，TMB 背景升高。

技巧：提前把試劑盒拿出冰箱 30 min，確保 22 ℃；孵育時間縮短到 45 min，信號足夠且背景 OD 450 nm <0.05。

9. TMB 顯色 12 min，用排槍統一加 100 µL

TMB 批間差來源主要是加液時間差。

操作：排槍預潤洗 2 次，從 A1→H12 順序 15 s 內完成；避光靜置 12 min，秒表到點立即加 50 µL Stop Solution，順序同加 TMB，減少孔間差。

10. 讀板 30 min 內完成，雙波長 450/630 nm

630 nm 校正 fingerprints 與劃痕。

設定：酶標儀“shake 3 s, settle 2 s"后讀數，30 min 內 OD 下降 <1 %；超過 30 min 酸性環境會使藍色變黃，信號掉 5 %。

11. 標準曲線四參數擬合，強制過 0 點會失真

IFN-γ 曲線 S 型底部有 5–7 pg/mL 平臺，強制 0 點會把低濃度樣本拉到負值。

軟件設置：四參數 Logistics，不約束 0 點，R2≥0.998；曲線后端 1000–2000 pg/mL 段偏差 <5 %。

12. 結果換算 × 稀釋倍數，再乘 0.92 修正系數

大鼠血清含 8 % 體積分數的細胞外液，IFN-γ 分布系數 0.92。

計算：

測得濃度 186 pg/mL × 2（稀釋）× 0.92 = 342 pg/mL 真實血清水平。

報告單位寫 pg/mL，不寫 ng/L，避免編輯部審稿時來回換算。

按 12 步跑完，一塊 96 孔板能同時測 40 只大鼠血清加 2 條標準曲線，板內 CV 3.8 %，板間 CV 6.2 %，符合 Immune Assay Standards 2025 草案。