1. 實驗設計：先算后做

• 孔徑選擇：6 孔板劃痕寬度≈1 mm，12 孔板≈0.5 mm。12 孔板節省 50% 試劑，適合高通量

• 細胞密度：劃痕邊緣需 100% 融合，推薦 2.5×10? cells/孔（6 孔板），過夜培養 12 h 即可達標

• EGF 濃度梯度：10 ng/mL 起跳，2 倍稀釋到 160 ng/mL，預實驗先跑 5 點，找到 EC50 后再縮窄窗口

2. 鋪板與劃痕：一次成型

• 槍頭法：200 μL 黃槍頭垂直壁面，一次拉到底，速度 1 cm/s，傾斜角 30°，劃痕彎曲度 <3%

• 模具法：3D 打印硅膠插片，厚度 0.3 mm，拆片后邊緣整齊，CV 值降到 5% 以內

• 清洗：PBS 輕沖 2 次，去掉脫落細胞，動作慢，水流速 <0.5 mL/s，避免二次損傷

3. EGF 刺激與成像節點

• 0 h 點：劃痕后 30 min 內完成首拍，超時會記錄到假性回縮

• 加入方式：37 °C 預溫培養基，沿壁緩慢加入，防止沖散單層

• 成像節奏：0、6、12、24 h，每孔 3 視野，10× 物鏡即可分辨單個細胞，文件命名統一“孔-視野-時間點"，后期批處理不出錯

4. 圖像分析：ImageJ 腳本

• 傷口面積插件：Wound Healing Tool，閾值設定 30–255，自動算出剩余面積

• 遷移速率公式：(A?－A?)/A? × 100%，單位 %/h

• 腳本批處理：宏命令循環 96 張圖，3 min 出完整表，Excel 直接調用

5. 數據質控：剔除異常

• 邊緣脫落：劃痕邊界出現鋸齒，面積 CV>15%，整孔作廢

• 細胞增殖干擾：Mitomycin C 10 μg/mL 預處理 1 h，24 h 內增殖率 <3%，遷移數據純化

• 焦距漂移：每板留 1 孔空白，實時校準，Z 軸誤差 ±2 μm 以內

6. 故障排查速查表

7. 結果呈現：排版出圖

• GraphPad 樣式：橫軸時間 h，縱軸遷移率 %，誤差線 SEM，n≥3

• 熱圖疊加：用 ImageJ 合成 0 h 與 24 h 偽彩，紅綠對比，審稿人一眼看懂

• 原始數據上傳：Figshare 或 Mendeley，DOI 引用，符合期刊開放數據要求

8. 進階玩法

• CRISPR 敲除：EGFR KO 細胞做同步對照，驗證通路特異性

• 微圖案化：在 50 μm 寬線條上劃痕，細胞只能單向遷移，消除方向噪聲

• 活細胞工作站：37 °C 5% CO? 艙內實時拍，每 15 min 一幀，生成遷移軌跡熱圖