KTP3006裂解液由50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1% NP-40、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS構成。NP-40的濃度誤差控制在±0.05%,脫氧膽酸鈉純度需達到98%以上。裂解液電導率在13-15mS/cm范圍內(25℃測定)。
試劑盒附帶的抑制劑混合物包含:AEBSF(1mM)、抑肽酶(2μg/mL)、亮抑酶肽(10μM)、胃酶抑素A(1μM)、EDTA(0.5mM)。AEBSF在水溶液中的半衰期為24小時,需在臨用前加入。EDTA濃度影響金屬依賴性蛋白酶的抑制效果,低于0.3mM時抑制效率下降40%。
使用HeLa細胞作為標準對照,每1×10^6個細胞的蛋白提取量應為80-120μg。提取后總蛋白濃度采用BCA法測定,標準曲線R2值需大于0.995。蛋白條帶在SDS-PAGE中覆蓋從10kDa到250kDa的范圍,其中GAPDH(37kDa)和肌動蛋白(42kDa)應清晰可見。
未開封試劑盒在2-8℃避光保存,有效期為12個月。裂解液開封后在4℃下可使用2周,長期儲存需分裝于-20℃。蛋白酶抑制劑的DMSO溶液在-80℃下穩定6個月,反復凍融不得超過3次。提取后的蛋白在-80℃下存放6個月,降解率低于10%。
所有操作應在4℃冷室或冰上進行。離心步驟要求離心機預冷至4℃,達到12,000×g時溫度上升不超過2℃。裂解液使用前需回溫至室溫并搖勻,若有沉淀出現,可在37℃水浴加熱5分鐘并劇烈震蕩。
KTP3006提取的總蛋白適用于BCA法、Bradford法、Lowry法定量。裂解液中的SDS濃度不超過0.1%,對Bradford法干擾明顯(吸光度偏差±20%),建議使用BCA法。提取物中的鹽濃度低于200mM時,不影響大部分激酶活性測定。
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