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免疫細胞化學免疫熒光 (ICCIF) 手把手教學! 一看就懂噻~

閱讀：207 發布時間：2025-10-31

請問 ICC 和 IF 有何區別？是同一個實驗嗎？

哎嘿，這題我會!

免疫細胞化學 (Immunocytochemistry, ICC) 在細胞樣本上對靶抗原進行檢測和定位。免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 則是主要使用熒光標記物對抗體進行標記，從而實現對抗原的可視化檢測。熒光標記既可以用于免疫細胞化學法 (細胞) 也可以用于免疫組織化學法 (組織)。

哇哦~曉得了，有沒有操作流程嘞?

流程？在下面嘍~

Section.01

第一步: 樣品準備

細胞免疫熒光技術是一種基于抗體與標記物相互作用的技術。它通過特異性的抗體與細胞表面或細胞內分子結合，再通過標記物在熒光顯微鏡下進行觀察。實驗流程通常包括樣品制備、固定、通透、封閉、抗體孵育、復染、封片和觀察 8 個部分。

圖 1. ICC/IF 實驗流程圖。

目的

根據實驗設計，準備狀態良好的細胞樣品。細胞培養是實驗的基礎，細胞狀態直接影響實驗結果。

步驟

1. 準備蓋玻片或共聚焦小皿。蓋玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，蓋玻片完-全干燥后移至細胞培養板中，整個過程注意無菌操作。

2. 鋪細胞。在包被的蓋玻片或板上鋪適當的細胞，使后續固定細胞時，融匯度達到 50-60%。如果細胞過密或過稀，正常細胞結構可能會受到影響。

3. 收集樣品。針對貼壁細胞，細胞繼續培養 12 h，細胞牢牢貼壁后，收集樣品進行后續操作。而對于懸浮細胞，可以通過甩片進行。

Tips:

1. 盡量選用新鮮制備的樣本，并確定樣品中抗原分子的表達豐度；

2. 后續所有操作，動作要輕柔，避免細胞脫落；

3. 后續所有操作都需避免干片。

Section.02

第二步: 固定

目的

使用固定劑 (如甲醇、丙酮、多聚甲醛等) 處理細胞，使蛋白質變性凝固，從而固定細胞形態和結構。同時，固定劑還能減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，保護抗原性。

固定劑的選擇

步驟

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定細胞 10 ~ 15 min；

2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留的固定液。

Tips:

1. 初次實驗，建議從 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 開始嘗試，倘若沒有達到預期效果，再調整固定時間或更換另一種固定劑。

2. 較長的孵育時間通常會導致更高的固定程度，直至表位可能過度固定。孵育時間短可能導致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時間需要根據經驗確定。

Section.03

第三步: 通透

目的

通過去污劑部分溶解細胞膜，形成孔洞，從而使抗體能夠到達細胞內表位，與細胞內的抗原結合。(該步驟可選做；通透步驟會破壞細胞膜，細胞膜表面抗原不適合選擇通透實驗)

圖 2. 細胞膜打孔處理示意圖。

通透劑的選擇

步驟

1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆蓋細胞，室溫下通透 5-10 min ；

2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留通透液。

Tips:

通透劑的濃度和孵育時間應針對所用樣品進行優化。

Section.04

第四步: 封閉

目的

封閉液中的成分能夠與細胞表面的非特異性位點結合，從而阻止抗體與這些位點的非特異性結合。

封閉液的選擇

可以選擇與二抗相同來源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗為山羊抗小鼠，應選擇山羊血清作為封閉劑。

步驟

使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室溫或 37 ℃ 封閉 1 h。

Tips:

1. 封閉溶液不應含有一抗的宿主動物血清，因為這可能會導致高背景。

2. 注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產生較高的背景。

Section.05

第五步: 抗體孵育

目的

使抗體充分與目的蛋白抗原結合，決定了熒光信號的位置和特異性，進而影響實驗結果的準確性和可靠性。

注意：該步驟可選擇 (i) 直接檢測，一抗直接與熒光基團偶聯。(ii) 間接檢測，使用合適的熒光標記二抗檢測一抗。這兩種方法各有優點和缺點，其中，間接檢測是最常-用的檢測方法。

圖 3. 直接法和間接法示意圖。

抗體的選擇

1. 單染：一抗要選擇任一宿主來源的抗體，二抗選擇對應的抗一抗宿主的抗體。例如，一抗是小鼠來源，二抗要選擇抗小鼠的抗體 (如山羊抗小鼠，驢抗小鼠等)。

2. 雙染/多染：在進行多個熒光標記實驗時，一抗要選擇不同宿主來源的抗體，二抗選擇對應的抗一抗宿主的抗體。同時要注意選擇具有高區分度的熒光二抗，避免熒光重疊。例如，在進行三色熒光標記時，一般選用綠色、藍色和紅色這三種熒光基團，以確保每個信號都能被清晰地區分出來。

步驟

(以間接檢測為例)：

1. 一抗孵育：根據研目標抗原和樣品特性選擇符合要求的一抗，并按照說明書要求稀釋一抗，加入到樣品中并在 4 ℃ 條件下孵育過夜 (12~16 h)。

2. 洗滌：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未結合的抗體。洗滌次數和時間可根據實驗條件調整。

3. 二抗孵育：根據一抗的種類及樣品特性 (二抗攜帶的熒光需要與樣品自帶熒光不沖突) 選擇合適的熒光標記的二抗，在室溫下避光孵育 1 h。稀釋和使用方法應遵循說明書。

4. 洗滌：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未結合的抗體。洗滌次數和時間可根據實驗條件調整。

Tips:

1. 孵育熒光二抗之后，一定要注意避光保存！

2. 確定合適的二抗工作濃度濃度，避免無信號或背景過高現象的發生；

3. 注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；

4. 洗滌時轉速要溫和，防止細胞脫片。

Section.06

第六步: 復染

目的

使用染色劑對細胞核進行染色，直觀地區分細胞核和其他細胞及抗原結構的位置，便于觀察和解讀實驗結果。

步驟

在清洗完畢的細胞中滴加 DAPI，室溫避光靜置約 30 s。

Section.07

第七步：封片

目的

保護已經染色的樣本，防止其受到外界環境的損害。同時，封片還有助于保存實驗結果，便于后續的分析和比較。

步驟

1. 封片：向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。

2. 觀察：輕輕用指甲油密封蓋玻片四周，避免樣品在顯微鏡下移動。指甲油干透后，直接觀察或 4 ℃ 下避光保存。

Tips:

1. 避免氣泡：在封片過程中，需要避免產生氣泡。氣泡會干擾顯微鏡下的觀察，影響實驗結果的準確性。因此，在滴加封片液時，需要緩慢而均勻地滴加，并用鑷子輕輕調整蓋玻片的位置，以確保沒有氣泡產生。

2. 選擇合適的封片劑：封片劑的選擇也很重要。常用的封片劑包括緩沖甘油、抗熒光淬滅封片液等。在選擇封片劑時，需要根據實驗的具體需求和標本的特性進行選擇。

3. 保持避光和濕度：封片后，需要將標本放置在避光和濕度適宜的環境中保存。這可以有效地防止熒光信號的淬滅和標本的干燥，確保實驗結果的穩定性和準確性。

4. 細胞樣品在封片劑處理后，理論上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，為了成像清晰和高熒光強度，建議盡快進行成像分析。

Section.08

第八步: 觀察

成像及分析：在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，并對熒光定位及結果進行實驗分析。

怎么樣？有沒有躍躍欲試的小念頭？讓我們再來看看科研人的期刊文獻中的免疫熒光 (IF) 成果圖吧！

圖 4. 亞細胞結構免疫熒光圖^[1]。

好啦，朋友們，到這里細胞免疫熒光實驗就結束啦！你學會了嗎？從準備樣本開始，一步步進行固定和抗體孵育，再到最后在顯微鏡下看到那些閃閃發光的細胞，真的超有成就感！

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[1] Thul PJ, et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 2017 May 26;356(6340):eaal3321.

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