細胞培養，又稱細胞克隆技術。科研中使用的細胞主要來源于動植物組織、人類捐獻的臨床樣本或商業細胞庫。

科研實驗常用到的細胞主要是原代細胞和細胞系。

• 來源：直接從動植物活體組織 (如手術切除的腫瘤組織、活檢樣本或實驗動物器官) 中分離提取出來的細胞。——更接近體內狀態。

• 特點：接近生物體內的真實生理狀態，實驗結果可信度高。但體外壽命有限，通常只能傳代幾次就會衰老死亡。

圖 1. 原代細胞分離和培養技術-以小鼠原代肝細胞為例^[1]。

• 定義： 原代細胞經傳代成功后，在體外具有無限增殖能力 (永生化) 或有限壽命的細胞群。——常用，一般從國家或專業細胞資源庫 (如 ATCC) 購買成熟的細胞系。

• 特點： 遺傳背景明確，生長均一性好，易于基因編輯和大規模培養。

既包括有限傳代細胞系 (傳代次數有限)，也包括連續/永生化細胞系 (可長期傳代)：

(1) 有限傳代細胞 (Finite Cell Line) : 能在體外分裂有限次數 (如人成纖維細胞系約傳 50 代后停止) 后衰老的細胞。——增殖受分裂次數限制。

(2) 無限細胞系 (Immortalized Cell Lines): 指通過基因突變/轉化或病毒感染，在體外培養中獲得無限增殖能力的細胞群體。——通常由原代細胞轉化而來，分裂次數可超過 50 代甚至無限傳代。

【舉例】人宮頸癌 HeLa 細胞——最著名的細胞系之一，是醫學上最早經由人工培養的永生不死的細胞，被廣泛用于醫學研究。

圖 2. HeLa 細胞光學顯微圖像^[2]。

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【原代細胞 VS 細胞系】

——怎么選更“適合"你的實驗？

原代細胞和細胞系都來源于真實生物組織，是體外實驗中常用的兩類模型，但二者在來源與建立方式、遺傳/表型穩定性、可控性與重復性、以及實驗定位上存在本質差異^[3][4]。

表1. 原代細胞與細胞系的區別。

             

細胞株是從原代培養物或細胞系中，通過單細胞克隆或特殊篩選，獲得具有特定遺傳特征、生物學標志或功能的純化細胞群。細胞株常用于特定的研究中，例如，某些細胞株被用于生產蛋白質、疫苗或其他生物制品。

很多人不太看重培養條件，認為自家細胞“能活"就行。但實際上，培養條件本身就會影響實驗結果。

——大家購買細胞時要看下培養說明，使用合適的細胞培養基培養。如在 ATCC ( American Type Culture Collection) 購買的細胞系來源和培養條件都可在其查詢得到。當然，往期也有為大家做過常用實驗細胞的培養方案的匯總。

表 2. 舉例：癌癥細胞的培養條件^[8]。

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細胞培養的流程大致為：接收細胞——處理細胞——細胞培養——細胞傳代——凍存與復蘇。詳細操作可查看往期推文：基礎細胞培養方法及步驟；細胞凍存與復蘇避坑指南。此外，還應注意一些關鍵的培養條件：

（1）培養基類型 (如 DMEM、RPMI 1640) ：不同細胞對葡萄糖、氨基酸、緩沖體系的需求不同。

表 3. 細胞培養：常見細胞培養基。

（2）血清及添加物：存在批次差異，是否熱滅活、保存與反復凍融也會影響細胞表現。

——MCE 可提供胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) ，其來源于非疫區健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、 BTV 等牛源病毒)，由剖腹產 5-8 月齡胎牛的血液制備而成，產地烏拉圭。

表 4. 細胞培養：血清常見問題。

（3）生長方式： (1) 貼壁細胞：需注意消化方式對表面蛋白的影響； (2) 懸浮細胞：需關注密度。

（4）傳代與密度：決定細胞是否進入應激、漂移或選擇性生長狀態，尤其是連續傳代時更明顯。

細胞培養？小心污染！目前，支原體污染仍是污染的根本原因，被稱為最“安靜"的實驗殺手。

支原體污染往往不引起培養基渾濁，也不一定明顯改變細胞形態，因此極易被忽視。但大量研究表明，它會顯著影響細胞的代謝狀態、增殖能力和基因表達譜，從而直接干擾藥物反應和實驗結論^[4][9]。

由于支原體污染不易被肉眼觀察到，因此需要借助一些檢測方法來確認。目前已開發出多種檢測細胞培養中支原體污染的方法，包括直接培養法、DNA 染色法、基于酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 的方法以及 PCR 檢測法等。點擊查看細胞支原體污染的檢測。

其中，PCR 類方法因靈敏度高、覆蓋面廣，更適合用于日常篩查，已成為多數細胞庫和實驗室的常規選擇^[4]。

圖 3. PCR 法檢測支原體：陽性與陰性結示例^[4]

(a) 常規 PCR 電泳結果示例：陰性樣本僅出現內參條帶，而陽性樣本可檢測到對應支原體的特異擴增條帶。(b) 實時 PCR 檢測曲線示例：陽性樣本出現明顯的擴增曲線，而陰性樣本僅顯示內參擴增信號。

支原體不是“偶發事故"，而是必須被假設“隨時可能存在"的風險變量。最穩妥的策略始終是：定期檢測 > 及時隔離 > 不指望“事后補救"。

國家實驗細胞資源共享平臺由中國科學院系統建設，整合了國內多家細胞庫資源，提供細胞來源、培養條件及質量控制等信息，是國內科研人員查詢和獲取標準化細胞資源的重要平臺。

ATCC 是國際上生物資源保藏機構之一，提供經過嚴格鑒定的細胞系及其詳細培養條件說明，廣泛作為國際科研和期刊投稿中推薦的細胞來源參考。

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參考文獻

[1]Charni-Natan M, et al. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR Protoc. 2020 Aug 13;1(2):100086.

[2] SHAYLA KABIR, et al. STUDY OF CHEMOPREVENTIVE ROLE OF PADDY HUSK ON CERVICAL ADENOCARCINOMA.HUMAN CELL LINE (HELA CELLS).ASIAN JOURNAL OF PHARMACEUTCALAND CUNICAL RESEARCH.Vol 17, Issue 3, 2024.

[3] Geraghty RJ, et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 2014 Sep 9;111(6):1021-46. doi: 10.1038/bjc.2014.166. Epub 2014 Aug 12.

[4] Weiskirchen S, et al. A Beginner's Guide to Cell Culture: Practical Advice for Preventing Needless Problems. Cells. 2023;12(5):682. Published 2023 Feb 21.

[5] Chan M, et al. Novel insights from a multiomics dissection of the Hayflick limit. Elife. 2022;11:e70283. Published 2022 Feb 4.

[6] Souren NY, et al. Cell line authentication: a necessity for reproducible biomedical research. EMBO J. 2022;41(14):e111307.

[7] Baust JM, Buehring GC, Campbell L, et al. Best practices in cell culture: an overview. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017;53(8):669-672.

[8] Hauser S, et al. Application of a Fluorescence Anisotropy-Based Assay to Quantify Transglutaminase 2 Activity in Cell Lysates. Int J Mol Sci. 2022 Apr 19;23(9):4475.

[9] Corral-Vázquez C, et al. Cell lines authentication and mycoplasma detection as minimun quality control of cell lines in biobanking. Cell Tissue Bank. 2017;18(2):271-280.