內參 (Internal Control/Reference) ：是指在科研實驗中作為基準參照物的一類分子，通常是蛋白質或 RNA。它們由管家基因編碼，在各種細胞或組織中恒定表達，不受實驗處理的影響。

內參擁有兩大核心特質：穩定性強、豐度高。

內參并不是“湊數條帶"，沒有規范內參的定量實驗，基本等于無效實驗。

內參可作為空白對照，評估實驗全流程。基于內參穩定性強、豐度高且穩定的特性，正常情況下，內參是一定能跑出來的！如果內參條帶清晰、整齊，說明你的樣品處理、電泳、轉膜、發光這些步驟都沒問題。

實驗中需要確保各個加樣孔的蛋白上樣量一致，排除因加樣體積偏差或蛋白定量不準導致的假陽性/假陰性。

正常情況下，顯色后，各個孔的內參條帶在肉眼觀察下寬度一致、灰度值 (或熒光強度) 相近，這可直觀表明每個泳道 (加樣孔) 的總蛋白轉膜量大致相同。

若內參條帶存在不清晰、缺失或深淺不一的情況，說明實驗本身存在問題，需要先回溯排查實驗步驟。

圖 1. 內參條帶的校正作用^[1]。

注意！！！校正看的是蛋白總質量，不是上樣體積！體積一致 ≠ 上樣量一致。

肉眼看條帶深淺，只能叫“感覺有差異"，不能叫“統計學差異"。所有正規 SCI 定量結果，必須經過歸一化 (Normalize) 校正：

WB 相對表達量 = 目的蛋白灰度值 ÷ 同泳道內參灰度值

圖 2. 肝組織中 ETV4 和 β-Actin 的蛋白水平，統計數據為平均值^[2]。

當然，部分文獻的 WB 結果圖下方還會附加一張柱狀圖，縱坐標即為“相對灰度值"，可以清晰直觀地展示出實驗組與對照組之間的表達差異。

圖 3. LOXL1 和 GAPDH 的蛋白水平，統計數據為平均值^[3]。

內參并不是隨便選一個就能用的。針對不同的實驗條件、不同的組織樣本以及不同的靶標蛋白，內參的選擇都有相應的講究。

原則上，內參的選擇是要根據目的蛋白的分子量大小以及樣本類型來定。

分子量最好相差 5 kDa 以上。

內參與目的蛋白分子量太近，條帶會粘連、重疊，無法單獨摳灰度定量；差距太大又會導致電泳分離過度，不在同一張膜有效區間。相差 5 kDa 以上最穩妥。

哺乳動物細胞/組織 (如人、小鼠、大鼠) 可選擇 GAPDH、β-Actin 等；

植物樣本則選擇 Plant Actin 等；

其他稀少物種：參照已發表文獻，選擇高度保守的管家基因表達蛋白作為內參。

首先要考慮的是，你的實驗處理是否影響內參？例如，某些特定的藥物處理或缺氧實驗可能會改變 GAPDH 的表達，此時建議使用 β-Actin 。

其次，還要考慮目的蛋白的表達部位。例如核蛋白的內參要考慮用 Lamin A，Lamin B，Histone H3 等；膜蛋白的內參一般用 N-Cadherin。

表 1. 不同表達部位常用內參。

磷酸化蛋白檢測需使用雙內參！！！

1. 常規內參：作為實驗體系的對照，如 GAPDH 等。

2. 磷酸化蛋白對應的總蛋白：如檢測 p-Akt 時，一定要同時檢測 Total-Akt。 因為磷酸化蛋白條帶變強弱，可能是總蛋白量變了，不是磷酸化水平變了，需要用總蛋白進行校正。

圖 4. 不同處理條件下，p-EGFR 與 Total-EGFR 表達的 WB 分析^[4]。

在進行缺氧或誘導糖尿病等處理時，GAPDH 的表達水平會發生顯著增高，不適合作為內參^[5]。  此時，可按需選擇使用 β-actin、α-Tubulin 或 Lamin B 做內參。

1. 缺氧環境：細胞在缺氧條件下，為維持能量代謝，會啟動代償機制來增強糖酵解途徑。作為糖酵解的關鍵酶，GAPDH 的表達量會被顯著上調。

圖 5. 慢性缺氧條件下 (HX)，GAPDH 表達量顯著上調^[5]。

2. 誘導糖尿病：在高糖環境或糖尿病模型中，細胞的代謝途徑，特別是葡萄糖代謝，發生劇烈改變，直接影響 GAPDH 的代謝活性和表達水平。

圖 6. 對照組和糖尿病患者 (n = 3) 胰腺組織蛋白 SOX9 和 NGN3 的 Western blot 結果^[6]。

此外，部分抗癌和真菌藥物處理時，Tubulin 表達會受影響,不適合作為內參。Tubulin 是細胞骨架的主要成分，而許多抗癌藥物 (如紫杉醇、長春堿) 和抗真菌藥物 (如灰黃霉素) 的作用機制正是通過靶向結合微管蛋白來干擾細胞分裂。因此，這類藥物處理會直接改變 Tubulin 的表達量或聚合狀態，導致其無法作為穩定的內參蛋白。此時，可嘗試選擇 β-actin、GAPDH、Histone H3 或 Lamin B 做內參。

             

1. 細胞增殖實驗：c-Jun 自身表達會變化，不適合作為內參^[9]。

2. 凋亡實驗：TBP、Lamin 在凋亡過程中表達或定位會變化，不適合作為核內參。

圖 9.  細胞凋亡 (細胞凋亡水平 RM>HM) 對 TBP 表達量的影響^[10]。

(1) 脂肪組織：β-Actin 的表達量非常低，不適合作為內參。

(2) 多組織多細胞樣本對比：GAPDH 作為代謝類蛋白，在活組織中表達比較恒定，因此多組織多細胞樣本對比時，建議選用 GAPDH 作內參^[11]。β-Actin 和 β-Tubulin 等結構蛋白在不同組織中會有表達差異。

(3) 細胞骨架相關的蛋白研究，不適合用 β-actin 作為內參，因為細胞骨架的重組可能會影響 β-actin 的表達。

(1) 骨骼肌、心肌、平滑肌：Tubulin 表達改變，不適合作為內參。

(2) 血漿、乳汁、組織液等分泌樣本：由于沒有完整的細胞結構，可選擇分泌型蛋白如 Transferrin 作內參。

下面是小 M 給大家整理匯總了常用內參！建議一鍵收藏，隨時翻看~

表 2. 常見內參選擇匯總。

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小結

總之，科研路上無捷徑，內參選擇亦是如此！小 M 在這里提醒大家：多查閱同領域、同實驗條件的相關文獻，再用預實驗把關，用心做好每一步，實驗之路才能順順利利！！

參考文獻

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