導師給了臨床樣本，你卻不知如何下手？想按照常規操作找靶點，卻毫無頭緒？本期，咱們就來嘮嘮，基于臨床樣本，如何尋找新靶點？

道理很簡單，先說思路：對比疾病人群的臨床樣本與正常對照，篩選出疾病發生發展過程中表達水平或功能發生顯著改變的關鍵生物分子，如蛋白質、差異基因等。這些生物分子可以作為后續藥物研究的潛在疾病靶點。

下面我們結合發表于Science Translational Medicine (IF=15)，題為 “A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis" 的文獻，一起來感受下該方法在科研中的實際應用^[1]。

臨床樣本并不是拿過來就能直接用的！

拿癌癥舉例，通常是采集患者的原代瘤體樣本，也就是從患者體內直接切除下來的新鮮組織，接著提取出腫瘤細胞，種植到免疫缺陷的小鼠體內，讓腫瘤在小鼠體內繁衍生長。——即：患者來源異種移植瘤 (PDX) 。然后再從小鼠體內的腫瘤中提取細胞，在實驗室的器皿中培養，最終形成了用來做科研實驗的穩定細胞系。該細胞系能夠高度還原患者原本的腫瘤特征，是科研研究和測試新藥的寶貴材料^[2]。

該文獻案例中，作者使用的源自原代 LUAD 患者細胞系 CRUK0748-XCL，就是來源于 TRACERx 研究中的患者來源異種移植瘤

圖 1. 肺癌 TRACERx 研究中 PDX 模型構建和擴增的研究方案示意圖^[3]。

CRISPR 全基因組篩選是一種高通量功能基因組學技術，利用 CRISPR/Cas 系統 (通常為 CRISPR-Cas9) 的基因編輯功能實現基因敲除、敲入、激活和干擾。將 CRISPR 系統應用于構建基因組文庫——構建全基因組 CRISPR 敲除 (CRISPRko)、干擾 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa) 文庫——進行高通量篩選，是疾病 (尤其是腫瘤) 靶基因研究的主要策略，廣泛應用于包括細胞系、小鼠和斑馬魚在內的多種模型中。

CRISPR 文庫多使用混合文庫形式進行高通量篩選。其操作流程主要包括設計合成 sgRNA 文庫、Cas9 細胞系的構建、表型選擇、高通量測序、生物信息學分析、候選基因和脫靶效應的驗證等 (圖 3)^[4]。

圖 2. CRISPR/Cas9 高通量篩選流程^[4]。

CRISPR/Cas9 技術可實現全基因組范圍的高通量篩選，其針對每個基因設計 3~10 條 sgRNA，利用芯片一次合成數萬條覆蓋整個基因組的 sgRNA 庫，經慢病毒包裝后以低感染復數感染宿主細胞，在適當的篩選條件下測試篩選前后 sgRNA 的豐度變化，進而找出候選基因。

該文獻案例中，作者使用的是 “人 Calabrese 全基因組 CRISPRa 文庫"，篩選能夠增強原位肺腺癌 (LUAD) 腫瘤腦轉移的基因。

——腫瘤轉移通常不是因為某個基因丟失了，而是因為某些原本不該表達的基因被異常激活、高表達，從而賦予了癌細胞侵襲和跨越屏障的能力。

Calabrese 文庫通過 CRISPRa 技術，強行上調人體 18,000 多個編碼基因的表達。賦予癌細胞“新的超能力"： 比如，某個肺癌細胞平時不具備穿透血腦屏障的能力，但文庫恰好激活了它體內的某個基質金屬蛋白酶基因，該細胞就突然獲得了“通關"能力。

CRISPRa 系統的運作包含兩部分：sgRNA (“導航地圖") 和 dCas9-轉錄激活因子 (“執行機器") ； Calabrese 文庫只有針對全基因組的 sgRNA 序列 (當然，也可以抗性篩選標記如 Puromycin，常用于尋找潛在的“耐藥基因") 。

dCas9-VP64 融合蛋白，需要細胞系預表達。該文獻案例中，作者將 CRUK0748-XCL 細胞系改造為 CRUK0748-XCL-GLD 細胞，使其表達催化失活的 dCas9 與 VP64 融合的蛋白 (用于激活基因轉錄) 、GFP 和熒光素酶 (用于體內追蹤) 。

簡單來說：使用了一種“沒有剪切活性"的突變 Cas9 蛋白 (稱為 dCas9) 。在 dCas9 上連了一些“轉錄激活因子" (如 VP64、p65、HSF1) 。當它被向導 RNA (sgRNA) 帶到基因的啟動子區域時，它不剪斷 DNA，而是像一個放大器一樣，招募細胞自身的轉錄機器，從而強烈提高目標基因的表達量。

作者將 CRUK0748-XCL-GLD 細胞以 0.3 的 MOI 進行轉染，并篩選至最終文庫覆蓋度為 500 倍。隨后經開胸手術，將轉染文庫的細胞直接接種到 30 只 NSG 小鼠的肺部 (圖 3)。

圖 3. 體內 CRISPR 激活篩選示意圖^[1]。

通過生物發光成像追蹤腫瘤負荷，終點對肺和腦組織進行 sgRNA 測序并比較其富集程度，結合 TCGA 與 DepMap 數據庫篩選出 12 個候選基因，其中 BACE1 的 sgRNA 在大腦中富集超過 150 倍。

隨后通過獨立 sgRNA 驗證、組織微陣列及臨床樣本分析發現，BACE1 表達增加會增強 LUAD 的骨髓轉移 (圖 4) 。此外，在 BACE1 過表達的肺腫瘤小鼠的肝臟和骨骼中，轉移負荷均有所增加。

圖 4. 使用兩種獨立的 sgRNA 激活 BACE1 表達可增加腦轉移腫瘤負荷^[1]。

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