單克隆抗體的制備及應用

        單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）是由單一B 細胞克隆產生、僅識別特定抗原表位的高度均一抗體，1975 年由 Kohler 和 Milstein 創立雜交瘤技術制備而成。單克隆抗體特異性強、純度高，廣泛用于 ELISA、Western blot、免疫沉淀、親和層析、流式細胞術等科研實驗，也是臨床診斷與靶向治療的重要工具，在生命科學與醫學領域應用價值突出。本期內容帶你讀懂什么是單克隆抗體？及其制備原理、制備流程與應用。

一、單克隆抗體的基本概述

        單克隆抗體定義由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。

圖1. 抗體結構

        通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有增殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。

        單克隆抗體類型單克隆抗體有兩種類型:①一種是識別初級蛋白結構的線性表位的抗體;②一種是識別二級、三級和更高結構的抗體。在生命科學研究中，使用識別線性表位的抗體包括ELISA和Westernblot方法。然而，使用這類抗體的應用有限而結構識別抗體有廣泛的應用，如免疫沉淀，免疫染色等。

二、單克隆抗體技術的基本原理

        要生產大量的單一抗體，必須滿足兩個條件：

        ①能分泌特異性抗體——B淋巴細胞具備這一能力，但它在體外不能無限增殖。②能在體外大量繁殖——骨髓瘤細胞（一種癌細胞）可以無限增殖，但它不分泌特定抗體。

圖2. 雜交瘤細胞同時具備親本細胞的兩大優勢

        科學家的奇思妙想是：把這兩種細胞融合在一起，讓一個細胞同時具備兩種"超能力"。 這就是雜交瘤細胞（hybridoma）——它繼承了B細胞的抗體合成能力，又獲得了骨髓瘤細胞的無限增殖能力。

三、單克隆抗體制備的基本流程

        單克隆抗體的制備過程拆解為5個關鍵步驟。

圖3. 單克隆抗體的制備流程

（1）免疫動物 

        免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

（2）細胞融合

  采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

（3）選擇性培養

選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。它的工作原理依賴于： 細胞合成 DNA 有兩條途徑。

HAT培養基的精妙設計H = Hypoxanthine 次黃嘌呤A= Aminopterin 氨基蝶呤（葉酸的拮抗劑）T= Thymidine 胸腺嘧啶核苷未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。

（4）雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

（5）單克隆抗體的制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內誘生法和體外培養法：①體內誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得單克隆抗體。②體外培養法  將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。近年來，新型培養技術和裝置不斷出現，提高了抗體的生產量。雜交瘤細胞融合后，要進行篩選后才能使用。雜交瘤細胞分為兩次：一次是篩選出雜交瘤細胞；另一次是在初選的雜交瘤細胞中篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，這兩次篩選的方法和原理各不相同。

四、單克隆抗體制備的應用

        單克隆抗體的制備可應用于以下生命科學實驗并具有醫用價值：

        （1）凝集實驗：haemaglutination

        （2）沉淀反應：Precipitation  reaction

        （3）ELISA 等免疫學檢測

        （4）親和層析：分離蛋白質

        （5）免疫印記（western  blotting)

        （6）免疫沉淀

        （7）BIAcore  biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力

        （8）放射免疫學方法檢測免疫復合物

        （9）磁珠分離細胞

        （10）流式細胞儀：用于細胞的分型和細胞分離

        （11）臨床疾病的診斷和治療