前言  

       由氨基酸組成的蛋白質和多肽是生命科學研究中必涉及的研究對象，作為生命體組成的基本單元之一，其研究深度和廣度也是超出很多人的想象。其涉及到生物醫學、食品、農業、制藥等多領域。當前，很多技術被用于分析蛋白和多肽，如氨基酸分析儀、圓二色光譜儀、拉曼光譜儀、XRD、FTIR、核磁共振、ITC、冷凍電鏡、SPR蛋白質相互作用等。拉曼光譜能夠快速獲取物質的化學結構信息，對于蛋白和多肽研究，拉曼光譜技術有其自身優勢，也有明顯的局限性，需要根據實際情況來選擇。

一、拉曼光譜技術在蛋白多肽分析領域的優勢

1、主要優勢——指紋光譜技術應用與蛋白多肽二級結構分析

       拉曼對分子化學鍵非常敏感，因此能夠用來分析蛋白多肽的化學結構，包括二級結構。如下圖1為蛋白質的典型拉曼光譜曲線，對照如下標記峰位，可以快速讀出所測蛋白的各組分組成及其含量。其中1000cm-1指向了苯丙氨酸，508cm-1指向S-S鍵；1600-1700cm-1為 Amide I帶，1200-1400cm-1 為Amide III帶，可計算解析α-helix、β-strand、Random coil等蛋白多肽的二級結構。Amide I帶相對于Amide III帶光譜更為清晰且容易擬合，因此多數報道采用Amide I帶的擬合結果。拉曼光譜在辨析化學結構方面的優勢可延伸出很多相關應用，如蛋白質變性（食品加工）、蛋白質相互作用（生命科學）、蛋白質微環境（溶劑效應）等。

                

                               圖1. 典型蛋白質指紋區拉曼光譜曲線

                

                              圖2. Amide I帶的解析計算蛋白二級結構比例

2、其他優勢——無損和快速

       拉曼為光激發散射現象，一般采用532nm、785nm等非紫外光激發，因此對樣品基本無損，可適用于蛋白溶液、生物細胞組織等各種體系的直接測量。測試時間一般為秒級，部分樣品短只0.1秒，相對于氨基酸分析儀、CD和冷凍電鏡等蛋白化學結構分析技術，測試效率非常明顯。

另外，相對于紅外光譜，水對拉曼信號的干擾相對較小，因此拉曼光譜允許活體細胞等含蛋白組分的樣品分析。

二、拉曼光譜技術在蛋白多肽分析領域的局限性

1、主要局限性——拉曼光譜技術不合適分析低濃度和復雜混合樣品

       拉曼散射的效率極低，為10-6級別，也就是10萬個光子照射樣品才會出現幾個拉曼散射光子信號。因此拉曼光譜技術非常適合分析半導體、碳材料、高分子材料、無機金屬氧化物等高純和高濃度的樣品。實際生產中，大部分蛋白在溶液或在生物體中都是微量存在，并且混入了多糖、核酸等其他生物活性物質。采用拉曼技術測量的信號會很弱，需要長積分時間。

       因此，對于蛋白多肽的拉曼測試，提高溶液濃度或選擇具有局部高濃度的樣品會獲得更有利的測試結果。常規來說，蛋白多肽溶液的濃度應該大于1%，最(好)能達到5%以上，盡量純化樣品有利于準確解析蛋白結構。當然，對于膠原蛋白、生物藥這類固體粉末或則高濃度純蛋白多肽樣品，是極(好)的拉曼測試樣品，拉曼信號很強。對于諸如細胞、動物組織等局部蛋白高濃度樣品也是非常適合拉曼的，采用高倍物鏡將光斑聚焦到微米級，能夠獲得高分辨率的細胞（組織）蛋白空間成像。如下圖細胞拉曼成像，細胞尾巴（藍色）組成為蛋白，通過拉曼掃描成像能夠清晰的辨別各組分的空間分布。

                  

2、其他局限性-拉曼成像速度慢

       如上所述，大多數含蛋白多肽樣品（細胞或動物組織）的拉曼信號較弱，拉曼測量時單點積分時間會比較長，如10秒甚至更長。細胞或動物組織本身又精細的結構，需要共聚焦拉曼進行高分辨率掃描，步進甚至要求達到0.5微米，按此計算，掃描1個10微米直徑的小型細胞，也需要超過1個小時。對于尺寸達到厘米級動物組織或器官，將是巨量時間，已經無實用價值。為了解決拉曼成像速度慢的問題，科學家研發出了受激拉曼和相干拉曼，拉曼成像速度可提高上萬倍。該技術需采用兩束飛秒激光器，因此設備極其昂貴，在此提供一張美圖，細節不再詳述。

三、蛋白多肽樣品對拉曼光譜儀設備有哪些主要要求？

（1）儀器的靈敏度

       由以上得知，蛋白多肽拉曼測試的核心問題是信號強度問題，在樣品濃度無法提升的情況下，儀器靈敏度越高越有利于該類樣品測試。儀器靈敏度由多因素組成，激光功率、激發/收集光學系統效率，探測器效率等。共聚焦拉曼光譜儀一般采用測量單晶硅三階峰來衡量，將另文介紹。

（2）光譜分辨率

       蛋白多肽由數個至數萬個氨基酸組成，內部化學結構非常復雜，因此拉曼光譜的峰位重疊現象非常明顯，以上介紹和文獻檢索都能看到，蛋白多肽的拉曼光譜有大量拉曼峰位相互交疊而成，采用高光譜分辨率拉曼更有利于解析蛋白多肽的化學結構變化。

（3）掃描成像功能

       除非是生物制藥企業等測量固定高純度樣品或僅研究液體蛋白多肽樣品，一般需要配置掃描成像功能，便于研究生物體不同區域蛋白多肽的結構及其變化。

（4）激發波長選擇

       波長選擇是拉曼光譜儀器選型的必修課，蛋白多肽存在色氨酸等發光基團，一套用于蛋白多肽測量的拉曼最(好)能配置2個波長（一般推薦532nm和785nm），以便適用于更多這類樣品的分析。

              

       上圖為示意圖，不適合所有類型樣品，熒光特性由樣品本身決定，需要進行單獨考察

四、DeepBlue200共聚焦顯微拉曼光譜儀蛋白實測效果

       1、樣品：多肽溶液

       2、樣品數量：5

       3、測試條件：

             4.1用移液器將多肽溶液滴在中空金屬支架上的保險膜上（保鮮膜可用手指按壓一下形成凹陷），盡量使液體成半球狀，厚度大于3mm；

             4.2 使用50X長焦物鏡；

             4.3 啟動拉曼實時采集功能，觀察樣品拉曼信號，在最(強)處停止，增加積分時間至10 s，記錄每個樣品的拉曼光譜 ；

       5、測試結果

          

                多肽溶液全拉曼光譜曲線

              其中2個樣品的Amide I帶拉曼光譜曲線擬合

        以上獲得了清晰的多肽拉曼光譜數據，不同樣品拉曼光譜特征明顯，達到了用戶區分多肽二級結構的要求。

五、儀器推薦

DeepBlue200是一款高性能全自動激光共聚焦顯微拉曼成像光譜儀，用于固體液體樣品的拉曼光譜測量，用于體相材料的拉曼光譜掃描成像。特點如下：

自動化：自動切換白光/激光光路，自動切換激發波長、自動選擇激光功率。

高靈敏：真共焦設計，極簡光路，高雜散光抑制能力無懼硅三階峰信噪比挑戰，直面激光不耐受和拉曼信號弱等難測樣品的考驗，如薄膜、小顆粒和稀溶液樣品。

穩定性：主要力學結構件和光機部件均采用高強度合金材料，結構力學重心下移光學部件剛性耦合，儀器具有極(佳)的穩定性，抗環境擾動能力強。

靈活性：DeepBlue200可采用全國產光學部件，為用戶提供低成本高性能解決方案，滿足大多數用戶需求；DeepBlue200也可集成進口高(端)光譜儀和XYZ掃描平臺，實現高光譜分辨率、高空間分辨率和大樣本自動分析等高級功能。